Az enzimkoncentráció növelésének a reakciósebességre gyakorolt hatásának vizsgálatához a szubsztrátnak felesleges mennyiségben kell jelen lennie, azaz a reakciónak függetlennek kell lennie a szubsztrát koncentrációjától. A képződött termék mennyiségének változása egy meghatározott idő alatt a jelen lévő enzim mennyiségétől függ. Grafikusan ez a következőképpen ábrázolható:
Ezeket a reakciókat “nulladik rendűnek” mondjuk, mert a sebességek függetlenek a szubsztrátkoncentrációtól, és egyenlőek valamilyen k konstanssal. A termékképződés olyan sebességgel zajlik, amely lineárisan függ az időtől. Több szubsztrát hozzáadása nem szolgálja a sebesség növelését. Nulla sorrendű kinetikában, ha a vizsgálatot kétszer annyi ideig hagyjuk futni, a termék mennyisége kétszeres lesz.
| Rend | Rátaegyenlet | |
|---|---|---|
| nulla | ráta = k | ráta független a szubsztrátkoncentrációtól |
| első | ráta = k | ráta arányos a szubsztrátkoncentráció első hatványával |
| második | ráta = k=k2 | ráta arányos a szubsztrátkoncentráció négyzetével |
| második | ráta = k | a sebesség arányos két reaktáns első hatványával |
A reakcióban jelen lévő enzim mennyiségét az általa katalizált aktivitással mérjük. Az aktivitás és a koncentráció közötti kapcsolatot számos tényező befolyásolja, például a hőmérséklet, a pH stb. Egy enzimpróbát úgy kell megtervezni, hogy a megfigyelt aktivitás arányos legyen a jelen lévő enzim mennyiségével, hogy az enzimkoncentráció legyen az egyetlen limitáló tényező. Ez csak akkor teljesül, ha a reakció nulladik rendű.
Az 5. ábrán az aktivitás az AB területen egyenesen arányos a koncentrációval, de a BC területen nem. Az enzimaktivitás általában akkor a legnagyobb, ha a szubsztrátkoncentráció nem korlátozó.
Ha egy enzimatikus reakció termékének koncentrációját az idő függvényében ábrázoljuk, hasonló görbét kapunk, 6. ábra.
A és B között a görbe nulladik rendű reakciót ábrázol, vagyis olyat, amelyben a sebesség az idővel állandó. Ahogy a szubsztrát elfogy, az enzim aktív helyei már nem telítődnek, a szubsztrátkoncentráció sebességkorlátozóvá válik, és a reakció B és C között elsőrendűvé válik.
Az enzimaktivitás ideális méréséhez a méréseket a görbe azon szakaszán kell elvégezni, ahol a reakció nulladik rendű. A reakció kezdetben nagy valószínűséggel nulladik rendű, mivel ekkor a legnagyobb a szubsztrátkoncentráció. Ahhoz, hogy biztosak legyünk abban, hogy a reakció nulladik rendű, többször kell mérni a termék (vagy szubsztrát) koncentrációját.
A 7. ábra három olyan reakciótípust szemléltet, amelyekkel az enzimvizsgálatok során találkozhatunk, és mutatja azokat a problémákat, amelyekkel akkor találkozhatunk, ha csak egyszeri méréseket végzünk.
A B egyenes egy nulladik rendű reakciót ábrázol, amely lehetővé teszi az enzimaktivitás pontos meghatározását a reakcióidő egy részében vagy egészében. Az A a 6. ábrán bemutatott reakciótípust képviseli. Ez a reakció kezdetben nulladik rendű, majd lelassul, feltehetően a szubsztrát kimerülése vagy a termék gátlása miatt. Az ilyen típusú reakciót néha “vezető” reakciónak nevezik. A valódi “potenciális” aktivitást a szaggatott vonal mutatja. A C görbe egy kezdeti “késleltetett” fázisú reakciót ábrázol. A szaggatott vonal ismét a potenciálisan mérhető aktivitást jelöli. A termékkoncentráció többszöri meghatározása lehetővé teszi az egyes görbék felrajzolását és a valódi aktivitás meghatározását. Az E-nél végzett egyetlen végpont-meghatározás azt a téves következtetést eredményezné, hogy mindhárom minta enzimkoncentrációja azonos.