Um die Auswirkung einer Erhöhung der Enzymkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit zu untersuchen, muss das Substrat in einer überschüssigen Menge vorhanden sein, d.h. die Reaktion muss unabhängig von der Substratkonzentration sein. Jede Änderung der Produktmenge, die über einen bestimmten Zeitraum gebildet wird, hängt von der Menge des vorhandenen Enzyms ab. Grafisch lässt sich dies wie folgt darstellen:
Diese Reaktionen werden als „Reaktionen nullter Ordnung“ bezeichnet, da die Raten unabhängig von der Substratkonzentration sind und einer Konstante k entsprechen. Die Bildung des Produkts verläuft linear mit der Zeit. Die Zugabe von mehr Substrat führt nicht zu einer Erhöhung der Geschwindigkeit. Bei der Kinetik nullter Ordnung führt die doppelte Zeit, die der Test läuft, zur doppelten Menge des Produkts.
| Ordnung | Ratengleichung | |
|---|---|---|
| Null | Rate = k | Rate ist unabhängig von der Substratkonzentration |
| erste | Rate = k | Rate ist proportional zur ersten Potenz der Substratkonzentration |
| zweite | Rate = k=k2 | Rate ist proportional zum Quadrat der Substratkonzentration |
| zweite | Rate = k | Rate ist proportional zur ersten Potenz von jedem der beiden Reaktanten |
Die Menge des in einer Reaktion vorhandenen Enzyms wird durch die Aktivität gemessen, die es katalysiert. Das Verhältnis zwischen Aktivität und Konzentration wird von vielen Faktoren wie Temperatur, pH-Wert usw. beeinflusst. Ein Enzymtest muss so ausgelegt sein, dass die beobachtete Aktivität proportional zur vorhandenen Enzymmenge ist, damit die Enzymkonzentration der einzige begrenzende Faktor ist. Sie ist nur dann erfüllt, wenn die Reaktion nullter Ordnung ist.
In Abbildung 5 ist die Aktivität direkt proportional zur Konzentration im Bereich AB, aber nicht im Bereich BC. Die Enzymaktivität ist im Allgemeinen am größten, wenn die Substratkonzentration unbegrenzt ist.
Wenn man die Konzentration des Produkts einer enzymatischen Reaktion gegen die Zeit aufträgt, ergibt sich eine ähnliche Kurve, Abbildung 6.
Zwischen A und B stellt die Kurve eine Reaktion nullter Ordnung dar, d. h. eine, bei der die Geschwindigkeit mit der Zeit konstant ist. Wenn das Substrat verbraucht ist, sind die aktiven Stellen des Enzyms nicht mehr gesättigt, die Substratkonzentration wird geschwindigkeitslimitierend und die Reaktion wird zwischen B und C zu einer Reaktion erster Ordnung.
Um die Enzymaktivität ideal zu messen, müssen die Messungen in dem Teil der Kurve vorgenommen werden, in dem die Reaktion nullter Ordnung ist. Es ist sehr wahrscheinlich, dass eine Reaktion anfangs nullter Ordnung ist, da die Substratkonzentration dann am höchsten ist. Um sicher zu sein, dass es sich um eine Reaktion nullter Ordnung handelt, müssen mehrere Messungen der Produkt- (oder Substrat-) Konzentration vorgenommen werden.
Abbildung 7 veranschaulicht drei Arten von Reaktionen, die bei Enzymtests auftreten können, und zeigt die Probleme, die auftreten können, wenn nur einzelne Messungen vorgenommen werden.
B ist eine gerade Linie, die eine Reaktion nullter Ordnung darstellt und eine genaue Bestimmung der Enzymaktivität für einen Teil oder die gesamte Reaktionszeit ermöglicht. A steht für die in Abbildung 6 gezeigte Art von Reaktion. Diese Reaktion verläuft anfangs mit nullter Ordnung und verlangsamt sich dann, vermutlich aufgrund der Erschöpfung des Substrats oder der Hemmung des Produkts. Diese Art von Reaktion wird manchmal als „führende“ Reaktion bezeichnet. Die echte „potenzielle“ Aktivität wird durch die gepunktete Linie dargestellt. Kurve C stellt eine Reaktion mit einer anfänglichen „verzögerten“ Phase dar. Auch hier stellt die gepunktete Linie die potenziell messbare Aktivität dar. Durch mehrfache Bestimmungen der Produktkonzentration kann jede Kurve aufgezeichnet und die tatsächliche Aktivität bestimmt werden. Eine einzige Endpunktbestimmung bei E würde zu dem falschen Schluss führen, dass alle drei Proben die gleiche Enzymkonzentration aufwiesen.