Pour étudier l’effet de l’augmentation de la concentration d’enzyme sur la vitesse de réaction, le substrat doit être présent en quantité excessive, c’est-à-dire que la réaction doit être indépendante de la concentration du substrat. Tout changement dans la quantité de produit formé sur une période de temps donnée dépendra du niveau d’enzyme présent. Graphiquement, cela peut être représenté comme suit:
Ces réactions sont dites « d’ordre zéro » parce que les taux sont indépendants de la concentration du substrat, et sont égaux à une certaine constante k. La formation du produit se déroule à une vitesse qui est linéaire avec le temps. L’ajout d’une plus grande quantité de substrat ne sert pas à augmenter la vitesse. Dans la cinétique d’ordre zéro, le fait de laisser l’essai se dérouler pendant le double du temps entraîne le double de la quantité de produit.
| Ordre | Équation du taux | |
|---|---|---|
| taux nul | =. k | taux est indépendant de la concentration en substrat |
| premier | taux = k | taux est proportionnel à la première puissance de la concentration en substrat |
| second | taux = k=k2 | taux est proportionnel au carré de la concentration en substrat |
| second | taux = k | le taux est proportionnel à la première puissance de chacun des deux réactifs |
La quantité d’enzyme présente dans une réaction est mesurée par l’activité qu’elle catalyse. La relation entre l’activité et la concentration est affectée par de nombreux facteurs tels que la température, le pH, etc. Un dosage enzymatique doit être conçu pour que l’activité observée soit proportionnelle à la quantité d’enzyme présente afin que la concentration en enzyme soit le seul facteur limitant. Elle n’est satisfaite que lorsque la réaction est d’ordre zéro.
Dans la figure 5, l’activité est directement proportionnelle à la concentration dans la zone AB, mais pas dans BC. L’activité enzymatique est généralement plus grande lorsque la concentration du substrat est illimitée.
Lorsque la concentration du produit d’une réaction enzymatique est tracée en fonction du temps, une courbe similaire en résulte, figure 6.
Entre A et B, la courbe représente une réaction d’ordre zéro, c’est-à-dire une réaction dans laquelle la vitesse est constante avec le temps. Au fur et à mesure de l’épuisement du substrat, les sites actifs de l’enzyme ne sont plus saturés, la concentration en substrat devient limitante de la vitesse, et la réaction devient de premier ordre entre B et C.
Pour mesurer idéalement l’activité enzymatique, les mesures doivent être effectuées dans la partie de la courbe où la réaction est d’ordre zéro. Une réaction est très probablement d’ordre zéro au départ puisque la concentration du substrat est alors la plus élevée. Pour être certain qu’une réaction est d’ordre zéro, de multiples mesures de la concentration du produit (ou du substrat) doivent être effectuées.
La figure 7 illustre trois types de réactions qui peuvent être rencontrées dans les essais enzymatiques et montre les problèmes qui pourraient être rencontrés si seulement des mesures uniques sont effectuées.
B est une ligne droite représentant une réaction d’ordre zéro qui permet une détermination précise de l’activité enzymatique pour une partie ou la totalité du temps de réaction. A représente le type de réaction qui a été montré dans la figure 6. Cette réaction est initialement d’ordre zéro puis ralentit, vraisemblablement en raison de l’épuisement du substrat ou de l’inhibition du produit. Ce type de réaction est parfois appelé « réaction de tête ». L’activité « potentielle » réelle est représentée par la ligne pointillée. La courbe C représente une réaction avec une phase initiale de « retard ». Là encore, la ligne en pointillé représente l’activité potentiellement mesurable. Des déterminations multiples de la concentration du produit permettent de tracer chaque courbe et de déterminer l’activité réelle. Une seule détermination du point final à E conduirait à la fausse conclusion que les trois échantillons avaient une concentration d’enzyme identique.