För att studera effekten av att öka enzymkoncentrationen på reaktionshastigheten måste substratet vara närvarande i en överskottsmängd, dvs. reaktionen måste vara oberoende av substratkoncentrationen. Varje förändring i mängden produkt som bildas under en bestämd tidsperiod kommer att vara beroende av mängden närvarande enzym. Grafiskt kan detta representeras som:
Dessa reaktioner sägs vara ”av nollordning” eftersom hastigheterna är oberoende av substratkoncentrationen och är lika med en viss konstant k. Produktbildningen fortskrider med en hastighet som är linjär med tiden. Tillsats av mer substrat tjänar inte till att öka hastigheten. Vid kinetik av nollordning resulterar det faktum att man låter analysen löpa under dubbel tid i en dubbelt så stor mängd produkt.
| Ordning | Rate Equation | |
|---|---|---|
| noll | rate = k | hastigheten är oberoende av substratkoncentrationen |
| första | hastigheten = k | hastigheten är proportionell mot första potensen av substratkoncentrationen |
| andra | hastighet = k=k2 | hastigheten är proportionell mot kvadraten på substratkoncentrationen |
| andra | hastighet = k | hastigheten är proportionell mot första potensen av var och en av två reaktanter |
Mängden enzym som finns i en reaktion mäts genom den aktivitet som det katalyserar. Förhållandet mellan aktivitet och koncentration påverkas av många faktorer som temperatur, pH-värde osv. En enzymanalys måste utformas så att den observerade aktiviteten är proportionell mot mängden närvarande enzym för att enzymkoncentrationen ska vara den enda begränsande faktorn. Den är uppfylld endast när reaktionen är av nollordning.
I figur 5 är aktiviteten direkt proportionell mot koncentrationen i området AB, men inte i BC. Enzymaktiviteten är i allmänhet störst när substratkoncentrationen är obegränsande.
När koncentrationen av produkten av en enzymatisk reaktion plottas mot tiden, resulterar en liknande kurva, figur 6.
Mellan A och B representerar kurvan en nollordningsreaktion, det vill säga en där hastigheten är konstant med tiden. När substratet förbrukas är enzymets aktiva platser inte längre mättade, substratkoncentrationen blir hastighetsbegränsande och reaktionen blir av första ordningen mellan B och C.
För att mäta enzymaktiviteten på ett idealiskt sätt måste mätningarna göras i den del av kurvan där reaktionen är av nollordning. En reaktion är mest troligt att vara av nollordning initialt eftersom substratkoncentrationen då är högst. För att vara säker på att en reaktion är av nollordning måste flera mätningar av produkt- (eller substrat-) koncentrationen göras.
Figur 7 illustrerar tre typer av reaktioner som kan förekomma i enzymtester och visar de problem som kan uppstå om endast enstaka mätningar görs.
B är en rät linje som representerar en nollordningsreaktion som tillåter noggrann bestämning av enzymaktiviteten under en del av eller hela reaktionstiden. A representerar den typ av reaktion som visades i figur 6. Denna reaktion är nollordig till en början och saktar sedan in, förmodligen på grund av att substratet är uttömt eller att produkten hämmas. Denna typ av reaktion kallas ibland för en ”ledande” reaktion. Den verkliga ”potentiella” aktiviteten representeras av den streckade linjen. Kurva C representerar en reaktion med en inledande ”eftersläpande” fas. Även här representerar den streckade linjen den potentiellt mätbara aktiviteten. Flera bestämningar av produktkoncentrationen gör det möjligt att plotta varje kurva och bestämma den verkliga aktiviteten. En enda bestämning av slutpunkten vid E skulle leda till den felaktiga slutsatsen att alla tre proverna hade identisk enzymkoncentration.