HPLC-separationssätt

I allmänhet kan tre primära egenskaper hos kemiska föreningar användas för att skapa HPLC-separation. De är:

– Polaritet
– Elektrisk laddning
– Molekylstorlek

Först ska vi betrakta polaritet och de två primära separationslägena som utnyttjar denna egenskap: normalfaskromatografi och kromatografi med omvänd fas.

Separationer baserade på polaritet

En molekyls struktur, aktivitet och fysikalisk-kemiska egenskaper bestäms av arrangemanget av dess beståndsdelar och bindningarna mellan dem. Inom en molekyl kallas en funktionell grupp för ett specifikt arrangemang av vissa atomer som ansvarar för speciella egenskaper och förutsägbara kemiska reaktioner. Denna struktur avgör ofta om molekylen är polär eller opolär. Organiska molekyler sorteras in i klasser beroende på vilken eller vilka funktionella grupper de innehåller. Med hjälp av en separationsmetod som bygger på polaritet bestäms den relativa kromatografiska retentionen av olika typer av molekyler till stor del av arten och placeringen av dessa funktionella grupper. Som visas i figur P kan klasser av molekyler ordnas efter deras relativa retention i ett område eller spektrum av kromatografisk polaritet från mycket polärt till mycket opolärt.

Figur P: Kromatografiskt polaritetsspektrum efter analytens funktionella grupp

Vatten är en polär förening. Bensen är en opolär förening. Molekyler med liknande kromatografisk polaritet tenderar att dras till varandra; molekyler med olikartad polaritet uppvisar mycket svagare attraktion, om någon, och kan till och med stöta bort varandra. Detta blir grunden för kromatografiska separationsmetoder baserade på polaritet.

Ett annat sätt att tänka på detta är genom den välkända analogin: olja och vatten blandas inte. Till skillnad från i magnetism där motsatta poler drar till sig varandra är kromatografiska separationer baserade på polaritet beroende av den starkare attraktionen mellan likheter och den svagare attraktionen mellan motsatser. Kom ihåg att ”lika attraherar lika” i polaritetsbaserad kromatografi

Figur Q: Korrekt kombination av mobil och stationär fas påverkar separation baserad på polaritet

För att utforma ett kromatografiskt separationssystem skapar vi konkurrens om de olika föreningar som finns i provet genom att välja en mobil fas och en stationär fas med olika polaritet. Då kommer föreningar i provet som har liknande polaritet som den stationära fasen att fördröjas eftersom de attraheras starkare av partiklarna. Föreningar vars polaritet liknar den mobila fasens polaritet kommer att föredra att attraheras av den och röra sig snabbare.

På detta sätt, baserat på skillnader i varje förenings relativa attraktion för varje fas, skapas en separation genom att förändra analyternas hastigheter.

Figurerna R-1, R-2 och R-3 visar typiska kromatografiska polaritetsintervall för mobila faser, stationära faser och analyter i provet, respektive. Låt oss betrakta var och en i tur och ordning för att se hur en kromatograf väljer lämpliga faser för att utveckla den attraktionskonkurrens som behövs för att uppnå en polaritetsbaserad HPLC-separation.

Figur R-1: Spektrum av mobilfasens kromatografiska polaritetsspektra

En skala, som den som visas i figur R-1, på vilken några vanliga lösningsmedel är placerade i ordning efter relativ kromatografisk polaritet kallas för en eluotropisk serie. Molekyler i den rörliga fasen som konkurrerar effektivt med analytiska molekyler om de attraktiva platserna i den stationära fasen tränger undan dessa analyter och får dem att röra sig snabbare genom kolonnen . Vatten befinner sig i den polära änden av skalan för rörlig fas och lösningsmedel, medan hexan, ett alifatiskt kolväte, befinner sig i den opolära änden. Däremellan kan enskilda lösningsmedel och blandningar av blandbara lösningsmedel placeras i ordning efter elutionsstyrka. Vilken ände av skalan som representerar den ”starkaste” rörliga fasen beror på karaktären hos den stationära fasens yta där konkurrensen om analysmolekylerna äger rum.

Figur R-2: Spektrum av polaritet i stationär fas med partikelkromatografi

Silica har en aktiv, hydrofil yta som innehåller sura funktionella silanolgrupper. Följaktligen hamnar den i den polära änden av skalan för stationär fas som visas i figur R-2. Aktiviteten eller polariteten hos kiseldioxidytan kan modifieras selektivt genom att kemiskt binda mindre polära funktionella grupper till den. De exempel som visas här omfattar, i fallande polaritet, cyanopropylsilyl- , n-octylsilyl- och n-octadecylsilyl- enheter på kiseldioxid. Det sistnämnda är en hydrofob , mycket opolär packning.

Figur R-3: Förenings/Analytes kromatografiska polaritetsspektrum

Figur R-3 upprepar det kromatografiska polaritetsspektrumet för vårt prov . Efter att ha beaktat polariteten hos båda faserna måste kromatografen för en given stationär fas välja en rörlig fas i vilken de intressanta analyterna hålls kvar, men inte så starkt att de inte kan elueras. Bland lösningsmedel med liknande styrka överväger kromatografen vilken faskombination som bäst kan utnyttja de mer subtila skillnaderna i analytens polaritet och löslighet för att maximera det kromatografiska systemets selektivitet. Lika attraherar lika, men som du förmodligen kan föreställa dig från diskussionen hittills krävs det kunskap om provet och erfarenhet av olika typer av analyter och retentionslägen för att skapa en separation baserad på polaritet. Sammanfattningsvis väljer kromatografen den bästa kombinationen av en mobil fas och en stationär partikelfas med lämpliga motsatta polariteter. När sedan provets analyter rör sig genom kolonnen kommer regeln likadana attraherar likadana att avgöra vilka analyter som saktar ner och vilka som fortsätter med högre hastighet.

Normalfas HPLC

I sina separationer av växtextrakt var Tswett framgångsrik med att använda en polär stationär fas med en mycket mindre polär mobil fas. Detta klassiska kromatografisätt blev känt som normalfas.

Figur S-1: Normalfas-kromatografi

Figur S-1 visar en normalfas-kromatografisk separation av vår testblandning med tre färgämnen. Den stationära fasen är polär och behåller det polära gula färgämnet starkast. Det relativt opolära blå färgämnet vinner i retentionskonkurrensen genom den mobila fasen, ett opolärt lösningsmedel, och elueras snabbt. Eftersom det blå färgämnet är mest likt den rörliga fasen rör det sig snabbare. Det är typiskt för normalfas-kromatografi på kiseldioxid att den rörliga fasen är 100 % organisk; inget vatten används.

HPLC i omvänd fas

Tecknet omvänd fas beskriver det kromatografiläge som är raka motsatsen till normalfas, nämligen användningen av en polär rörlig fas och en opolär stationär fas. Figur S-2 illustrerar den svarta trefärgningsblandningen som separeras med hjälp av ett sådant protokoll.

Figur S-2: Omvänd fas-kromatografi

Nu är den starkast kvarhållna föreningen det mer opolära blåa färgämnet, eftersom dess attraktionskraft till den opolära stationära fasen är störst. Det polära gula färgämnet, som hålls svagt kvar, vinner i konkurrensen med den polära, vattenhaltiga rörliga fasen, rör sig snabbast genom bädden och elueras tidigast när lika attraherar lika.

I dag används omvänd fas-kromatografi för cirka 75 % av alla HPLC-metoder, eftersom den är mer reproducerbar och har en bred användbarhet. De flesta av dessa protokoll använder som rörlig fas en vattenblandning av vatten med ett blandbart, polärt organiskt lösningsmedel, t.ex. acetonitril eller metanol. Detta säkerställer vanligtvis att analyterna interagerar korrekt med den opolära, hydrofoba partikelytan. C18-bunden kiseldioxid är den mest populära typen av HPLC-förpackning för omvänd fas.

Tabell C innehåller en sammanfattning av fasegenskaperna för de två huvudsakliga HPLC-separationssätten baserat på polaritet. Kom ihåg att för dessa polaritetsbaserade lägen gäller att lika lockar lika.

Tabell C: Fasegenskaper för separationer baserade på polaritet

Hydrofil interaktionskromatografi

HILIC kan ses som en variant av normalfaskromatografi. Vid normalfas-kromatografi är den rörliga fasen 100 % organisk. Endast spår av vatten finns i den rörliga fasen och i porerna hos de polära packningspartiklarna. Polära analyter binder starkt till den polära stationära fasen och kan inte eluera.

Inblandning av lite vatten i den organiska rörliga fasen gör det möjligt att separera och eluera polära föreningar som är starkt fasthållna i normalfasmodellen . Vatten, som är ett mycket polärt lösningsmedel, konkurrerar effektivt med polära analyter om den stationära fasen. HILIC kan köras i antingen isokratiskt eller gradient-elutionsläge. Polära föreningar som till en början attraheras av partiklarna i det polära packningsmaterialet kan elueras när polariteten i den rörliga fasen ökas. Analyterna elueras i ordning med ökande hydrofilitet . Buffertar eller salter kan tillsättas till den rörliga fasen för att hålla joniserbara analyter i en enda form.

Hydrofob interaktionskromatografi

HIC är en typ av kromatografi i omvänd fas som används för att separera stora biomolekyler, t.ex. proteiner. Det är vanligtvis önskvärt att behålla dessa molekyler intakta i en vattenlösning och undvika kontakt med organiska lösningsmedel eller ytor som kan denaturera dem. HIC utnyttjar den hydrofoba interaktionen mellan stora molekyler och en måttligt hydrofob stationär fas, t.ex. butylbunden , snarare än oktadekylbunden , kiseldioxid. Initialt kommer högre saltkoncentrationer i vatten att uppmuntra proteinerna att hållas kvar på packningen. Gradientseparationer utförs vanligtvis genom att minska saltkoncentrationen. På detta sätt elueras biomolekylerna i ordning med ökande hydrofobicitet.

Separationer baserade på laddning: För separationer baserade på polaritet dras likadana till likadana och motsatser kan stötas bort. Vid jonbyteskromatografi och andra separationer baserade på elektrisk laddning är regeln omvänd. Likheter kan stötas bort medan motsatser dras till varandra. Stationära faser för jonbytesseparation kännetecknas av karaktären och styrkan hos de sura eller basiska funktionerna på deras ytor och de typer av joner som de attraherar och behåller. Kationsutbyte används för att behålla och separera positivt laddade joner på en negativ yta. Omvänt används anjonbyte för att hålla kvar och separera negativt laddade joner på en positiv yta. För varje typ av jonbyte finns det minst två allmänna metoder för separation och eluering.

Figur T: Jonbyteskromatografi

Starka jonbytare bär på funktionella grupper som alltid är joniserade. De används vanligtvis för att behålla och separera svaga joner. Dessa svaga joner kan elueras genom förskjutning med en mobil fas som innehåller joner som attraheras starkare till den stationära fasens platser. Alternativt kan svaga joner hållas kvar på kolonnen och sedan neutraliseras genom att in situ ändra pH-värdet i den rörliga fasen, vilket gör att de förlorar sin attraktionskraft och elueras.

Svaga jonbytare kan neutraliseras över eller under ett visst pH-värde och förlora sin förmåga att hålla kvar joner genom laddning. När de är laddade används de för att behålla och separera starka joner. Om dessa joner inte kan elueras genom förskjutning kan den stationära fasens utbytesplatser neutraliseras, vilket stänger av den joniska attraktionen och möjliggör eluering av de laddade analyterna.

Tabell D: Riktlinjer för jonbytare

När svaga jonbytare neutraliseras kan de hålla kvar och separera arter genom hydrofoba eller hydrofila växelverkningar; i dessa fall bestäms elueringsstyrkan av polariteten hos den mobila fasen . Svaga jonbytare kan således användas för separationer med blandat läge.

Tabell D innehåller riktlinjer för de viktigaste kategorierna av jonbyte. För att behålla en starkt basisk analyt kan man t.ex. använda en stationär faspartikel med svag katjonväxling vid pH > 7, vilket garanterar en negativt laddad partikelyta. För att frigöra eller eluera den starka basen sänker man den rörliga fasens pH-värde till under 3. Detta avlägsnar ytladdningen och stänger av jonbytesmekanismen.

Notera att pKa är det pH-värde vid vilket 50 % av den funktionella gruppen är joniserad och 50 % är neutral. För att säkerställa en i huvudsak neutral, eller en fullt laddad, analyt eller partikelyta måste pH-värdet justeras till ett värde som ligger minst 2 enheter över pKa-värdet, beroende på vad som är lämpligt.

Använd inte en utbytare med starka katjoner för att behålla en stark bas; båda förblir laddade och attraheras starkt av varandra, vilket gör att basen blir nästan omöjlig att eluera. Den kan endast avlägsnas genom att överösa den starka katjonbytaren med en konkurrerande bas som uppvisar ännu starkare retention och tränger undan den aktuella föreningen genom att vinna konkurrensen om de aktiva bytesplatserna. Detta tillvägagångssätt är sällan praktiskt eller säkert i HPLC och SPE.

Separation baserad på storlek: På 1950-talet upptäckte Porath och Flodin att biomolekyler kunde separeras utifrån sin storlek, snarare än utifrån sin laddning eller polaritet, genom att passera eller filtrera dem genom en hydrofil polymer av dextran med kontrollerad porositet och hydrofilitet. Denna process kallades för gelfiltrering. Senare användes ett analogt system för att separera syntetiska oligomerer och polymerer med hjälp av förpackningar av organiska polymerer med specifika porstorleksintervall. Denna process kallades gelpermeationskromatografi . Liknande separationer med hjälp av kiseldioxidpackningar med kontrollerad porositet kallades size-exclusionskromatografi . De första kommersiella HPLC-instrumenten, som introducerades 1963, var utformade för GPC-tillämpningar.

Alla dessa tekniker utförs vanligen på stationära faser som har syntetiserats med en porstorleksfördelning inom ett område som gör det möjligt för de analyter som är av intresse att komma in i, eller att uteslutas från, en större eller mindre del av porvolymen i packningen. Mindre molekyler penetrerar fler av porerna vid sin passage genom bädden. Större molekyler kan endast tränga igenom porer över en viss storlek, så att de tillbringar mindre tid i bädden. De största molekylerna kan helt uteslutas från porerna och passerar endast mellan partiklarna och elueras mycket snabbt i en liten volym. Mobila faser väljs av två skäl: för det första är de goda lösningsmedel för analyterna och för det andra kan de förhindra interaktioner mellan analyterna och den stationära fasens yta. På detta sätt elueras de större molekylerna först, medan de mindre molekylerna färdas långsammare och elueras senare, i fallande ordning efter deras storlek i lösningen. Därav den enkla regeln: De stora kommer ut först.

Då det är möjligt att korrelera molekylvikten hos en polymer med dess storlek i lösning, revolutionerade GPC mätningen av molekylviktsfördelningen hos polymerer som i sin tur bestämmer de fysikaliska egenskaper som kan förbättra, eller försämra, polymerbearbetning, kvalitet och prestanda.

Slutsats