In generale, tre caratteristiche primarie dei composti chimici possono essere utilizzate per creare separazioni HPLC. Esse sono:
– Polarità
– Carica elettrica
– Dimensione molecolare
Primo, consideriamo la polarità e le due principali modalità di separazione che sfruttano questa caratteristica: la cromatografia in fase normale e in fase inversa.
Separazione basata sulla polarità
La struttura, l’attività e le caratteristiche fisico-chimiche di una molecola sono determinate dalla disposizione dei suoi atomi costituenti e dai legami tra loro. All’interno di una molecola, una disposizione specifica di certi atomi che è responsabile di proprietà speciali e reazioni chimiche prevedibili è chiamata gruppo funzionale. Questa struttura spesso determina se la molecola è polare o non polare. Le molecole organiche sono ordinate in classi in base al gruppo o ai gruppi funzionali principali che contengono. Usando una modalità di separazione basata sulla polarità, la ritenzione cromatografica relativa di diversi tipi di molecole è in gran parte determinata dalla natura e dalla posizione di questi gruppi funzionali. Come mostrato nella Figura P, le classi di molecole possono essere ordinate in base alla loro ritenzione relativa in un intervallo o spettro di polarità cromatografica da altamente polare a altamente non polare.
Figura P: spettro di polarità cromatografica per gruppo funzionale dell’analita
L’acqua è un composto polare. Il benzene è un composto non polare. Le molecole con polarità cromatografica simile tendono ad essere attratte l’una dall’altra; quelle con polarità dissimile mostrano un’attrazione molto più debole, se non addirittura si respingono. Questo diventa la base per le modalità di separazione cromatografica basate sulla polarità.
Un altro modo per pensare a questo è l’analogia familiare: olio e acqua non si mescolano. A differenza del magnetismo, dove i poli opposti si attraggono a vicenda, le separazioni cromatografiche basate sulla polarità dipendono dall’attrazione più forte tra i simili e dall’attrazione più debole tra gli opposti. Ricorda, “Il simile attrae il simile” nella cromatografia basata sulla polarità.
Figura Q: La corretta combinazione di fasi mobili e stazionarie influenza la separazione basata sulla polarità
Per progettare un sistema di separazione cromatografica, si crea una competizione per i vari composti contenuti nel campione scegliendo una fase mobile e una fase stazionaria con polarità diverse. Quindi, i composti nel campione che sono simili per polarità alla fase stazionaria saranno ritardati perché sono più fortemente attratti dalle particelle. I composti la cui polarità è simile a quella della fase mobile saranno attratti preferenzialmente da essa e si muoveranno più velocemente.
In questo modo, sulla base delle differenze nell’attrazione relativa di ogni composto per ogni fase, si crea una separazione cambiando le velocità degli analiti.
Le figure R-1, R-2 e R-3 mostrano i tipici intervalli di polarità cromatografica per le fasi mobili, le fasi stazionarie e gli analiti del campione, rispettivamente. Consideriamo ciascuno di essi a turno per vedere come un cromatografo sceglie le fasi appropriate per sviluppare la competizione di attrazione necessaria per ottenere una separazione HPLC basata sulla polarità.
Figura R-1: Spettro di polarità cromatografica della fase mobile
Una scala, come quella mostrata nella Figura R-1, sulla quale alcuni solventi comuni sono posti in ordine di polarità cromatografica relativa è chiamata serie eluotropica. Le molecole della fase mobile che competono efficacemente con le molecole dell’analita per i siti attraenti della fase stazionaria spostano questi analiti, inducendoli a muoversi più velocemente attraverso la colonna. L’acqua è all’estremità polare della scala fase mobile-solvente, mentre l’esano, un idrocarburo alifatico, è all’estremità non polare. Nel mezzo, i singoli solventi, così come le miscele di solventi miscibili, possono essere messi in ordine di forza di eluizione. Quale estremità della scala rappresenti la fase mobile “più forte” dipende dalla natura della superficie della fase stazionaria dove avviene la competizione per le molecole dell’analita.
Figura R-2: Spettro di polarità cromatografica di particelle in fase stazionaria
La silice ha una superficie attiva, idrofila, contenente gruppi funzionali silanolici acidi. Di conseguenza, cade all’estremità polare della scala della fase stazionaria mostrata nella Figura R-2. L’attività o la polarità della superficie della silice può essere modificata selettivamente legando chimicamente ad essa gruppi funzionali meno polari. Gli esempi mostrati qui includono, in ordine di polarità decrescente, cyanopropylsilyl- , n-octylsilyl- , e n-octadecylsilyl- moieties su silice. Quest’ultimo è un imballaggio idrofobo e molto non polare.
Figura R-3: Spettro di polarità cromatografica composto/analita
La figura R-3 ripete lo spettro di polarità cromatografica del nostro campione. Dopo aver considerato la polarità di entrambe le fasi, quindi, per una data fase stazionaria, un cromatografo deve scegliere una fase mobile in cui gli analiti di interesse siano trattenuti, ma non così fortemente da non poter essere eluiti. Tra solventi di forza simile, il cromatografo considera quale combinazione di fasi può sfruttare al meglio le differenze più sottili nella polarità e solubilità dell’analita per massimizzare la selettività del sistema cromatografico. Il simile attrae il simile, ma, come probabilmente puoi immaginare dalla discussione finora, creare una separazione basata sulla polarità implica la conoscenza del campione e l’esperienza con vari tipi di analiti e modalità di ritenzione. Per riassumere, il cromatografo sceglierà la migliore combinazione di una fase mobile e di una fase stazionaria di particelle con polarità opportunamente opposte. Poi, mentre gli analiti del campione si muovono attraverso la colonna, la regola che il simile attrae il simile determinerà quali analiti rallentano e quali procedono ad una velocità maggiore.
HPLC a fase normale
Nelle sue separazioni di estratti di piante, Tswett ebbe successo usando una fase stazionaria polare con una fase mobile molto meno polare. Questa modalità classica di cromatografia divenne nota come fase normale.
Figura S-1: Cromatografia a fase normale
La figura S-1 rappresenta una separazione cromatografica in fase normale della nostra miscela di test a tre colori. La fase stazionaria è polare e trattiene il colorante giallo polare più fortemente. Il colorante blu relativamente non polare è vinto nella competizione di ritenzione dalla fase mobile, un solvente non polare, ed eluisce rapidamente. Poiché il colorante blu è più simile alla fase mobile, si muove più velocemente. È tipico della cromatografia in fase normale su silice che la fase mobile sia organica al 100%; non viene usata acqua.
HPLC a fase inversa
Il termine fase inversa descrive la modalità cromatografica che è esattamente l’opposto della fase normale, cioè l’uso di una fase mobile polare e una fase stazionaria non polare. La figura S-2 illustra la miscela nera a tre colori che viene separata utilizzando un tale protocollo.
Figura S-2: Cromatografia a fase inversa
Ora il composto più fortemente trattenuto è il colorante blu più non polare, poiché la sua attrazione per la fase stazionaria non polare è maggiore. Il colorante giallo polare, essendo debolmente trattenuto, è vinto nella competizione dalla fase mobile acquosa polare, si muove più velocemente attraverso il letto, ed eluisce prima che il simile attragga il simile.
Oggi, poiché è più riproducibile e ha un’ampia applicabilità, la cromatografia a fase inversa è usata per circa il 75% di tutti i metodi HPLC. La maggior parte di questi protocolli utilizza come fase mobile una miscela acquosa di acqua con un solvente organico polare miscibile, come l’acetonitrile o il metanolo. Questo tipicamente assicura la corretta interazione degli analiti con la superficie non polare e idrofoba delle particelle. Una silice con legame C18 è il tipo più diffuso di imballaggio HPLC a fase inversa.
La tabella C presenta un riassunto delle caratteristiche della fase per le due principali modalità di separazione HPLC basate sulla polarità. Ricorda, per queste modalità basate sulla polarità, il simile si attrae.
Tabella C: Caratteristiche di fase per separazioni basate sulla polarità
Cromatografia a interazione idrofila
HILIC può essere vista come una variante della cromatografia in fase normale. Nella cromatografia in fase normale, la fase mobile è 100% organica. Solo tracce di acqua sono presenti nella fase mobile e nei pori delle particelle di imballaggio polari. Gli analiti polari si legano fortemente alla fase stazionaria polare e potrebbero non eluire.
L’aggiunta di acqua alla fase mobile organica permette di separare ed eluire i composti polari che sono fortemente trattenuti nella modalità a fase normale. L’acqua, un solvente molto polare, compete efficacemente con gli analiti polari per la fase stazionaria. La HILIC può essere eseguita in modalità di eluizione isocratica o gradiente. I composti polari che sono inizialmente attratti dalle particelle di materiale di imballaggio polare possono essere eluiti man mano che la polarità della fase mobile viene aumentata. Gli analiti vengono eluiti in ordine di idrofilia crescente. I tamponi o i sali possono essere aggiunti alla fase mobile per mantenere gli analiti ionizzabili in un’unica forma.
Cromatografia a interazione idrofobica
HIC è un tipo di cromatografia a fase inversa che viene utilizzata per separare grandi biomolecole, come le proteine. Di solito è auspicabile mantenere queste molecole intatte in una soluzione acquosa, evitando il contatto con solventi organici o superfici che potrebbero denaturarle. L’HIC sfrutta l’interazione idrofobica delle grandi molecole con una fase stazionaria moderatamente idrofoba, ad esempio, legata al butile, piuttosto che all’ottadecile, alla silice. Inizialmente, concentrazioni di sale più alte nell’acqua incoraggeranno le proteine ad essere trattenute sull’imballaggio. Le separazioni a gradiente sono tipicamente eseguite diminuendo la concentrazione di sale. In questo modo, le biomolecole vengono eluite in ordine di idrofobicità crescente.
Separazioni basate sulla carica: Cromatografia a scambio ionico
Per le separazioni basate sulla polarità, il simile è attratto dal simile e gli opposti possono essere respinti. Nella cromatografia a scambio ionico e in altre separazioni basate sulla carica elettrica, la regola è invertita. I simili possono respingersi, mentre gli opposti sono attratti l’uno dall’altro. Le fasi stazionarie per le separazioni a scambio ionico sono caratterizzate dalla natura e dalla forza delle funzioni acide o basiche sulle loro superfici e dai tipi di ioni che attraggono e trattengono. Lo scambio cationico è usato per trattenere e separare ioni caricati positivamente su una superficie negativa. Al contrario, lo scambio di anioni è usato per trattenere e separare ioni caricati negativamente su una superficie positiva. Con ogni tipo di scambio ionico, ci sono almeno due approcci generali per la separazione e l’eluizione.
Figura T: Cromatografia a scambio ionico
Gli scambiatori di ioni forti portano gruppi funzionali che sono sempre ionizzati. Sono tipicamente usati per trattenere e separare gli ioni deboli. Questi ioni deboli possono essere eluiti per spostamento con una fase mobile contenente ioni che sono più fortemente attratti dai siti della fase stazionaria. In alternativa, gli ioni deboli possono essere trattenuti sulla colonna, quindi neutralizzati cambiando in situ il pH della fase mobile, facendoli perdere la loro attrazione ed eluire.
Gli scambiatori di ioni deboli possono essere neutralizzati sopra o sotto un certo valore di pH e perdere la loro capacità di trattenere gli ioni per carica. Quando sono carichi, sono usati per trattenere e separare gli ioni forti. Se questi ioni non possono essere eluiti per spostamento, allora i siti di scambio della fase stazionaria possono essere neutralizzati, spegnendo l’attrazione ionica e permettendo l’eluizione degli analiti carichi.
Tabella D: Linee guida per lo scambio ionico
Quando gli scambiatori di ioni deboli sono neutralizzati, possono trattenere e separare specie tramite interazioni idrofobiche o idrofile; in questi casi, la forza di eluizione è determinata dalla polarità della fase mobile. Così, gli scambiatori di ioni deboli possono essere utilizzati per separazioni in modalità mista.
La tabella D delinea le linee guida per le principali categorie di scambio ionico. Ad esempio, per trattenere un analita fortemente basico, utilizzare una particella di fase stazionaria a scambio cationico debole a pH > 7; questo assicura una superficie della particella caricata negativamente. Per rilasciare o eluire la base forte, abbassare il pH della fase mobile sotto 3; questo rimuove la carica superficiale e spegne il meccanismo di ritenzione a scambio ionico.
Nota che un pKa è il valore di pH al quale il 50% del gruppo funzionale è ionizzato e il 50% è neutro. Per assicurare una superficie dell’analita o della particella essenzialmente neutra o completamente carica, il pH deve essere regolato ad un valore di almeno 2 unità oltre il pKa, come appropriato.
Non usare uno scambiatore a cationi forti per trattenere una base forte; entrambi rimangono carichi e fortemente attratti l’uno dall’altro, rendendo la base quasi impossibile da eluire. Essa può essere rimossa solo ingolfando lo scambiatore cationico forte con una base concorrente che mostra una ritenzione ancora più forte e sposta il composto di interesse vincendo la competizione per i siti di scambio attivi. Questo approccio è raramente pratico, o sicuro, in HPLC e SPE.
Separazioni basate sulla dimensione: Size-Exclusion Chromatography –
Negli anni 50, Porath e Flodin scoprirono che le biomolecole potevano essere separate in base alle loro dimensioni, piuttosto che alla loro carica o polarità, facendole passare, o filtrando, attraverso un polimero di destrano idrofilo a porosità controllata. Questo processo è stato chiamato filtrazione del gel. Più tardi, uno schema analogo è stato usato per separare oligomeri e polimeri sintetici usando impacchi di polimeri organici con pori di dimensioni specifiche. Questo processo è stato chiamato cromatografia a permeazione di gel. Separazioni simili fatte usando impacchi di silice a porosità controllata sono state chiamate cromatografia a esclusione di dimensione. Introdotti nel 1963, i primi strumenti HPLC commerciali sono stati progettati per applicazioni GPC.
Tutte queste tecniche sono tipicamente fatte su fasi stazionarie che sono state sintetizzate con una distribuzione di dimensioni dei pori in una gamma che permette agli analiti di interesse di entrare, o di essere esclusi da, più o meno del volume dei pori dell’imballaggio. Le molecole più piccole penetrano più dei pori nel loro passaggio attraverso il letto. Le molecole più grandi possono penetrare solo nei pori al di sopra di una certa dimensione, quindi passano meno tempo nel letto. Le molecole più grandi possono essere totalmente escluse dai pori e passare solo tra le particelle, eluendo molto rapidamente in un piccolo volume. Le fasi mobili sono scelte per due motivi: primo, sono buoni solventi per gli analiti; e, secondo, possono prevenire qualsiasi interazione tra gli analiti e la superficie della fase stazionaria. In questo modo, le molecole più grandi eluiscono per prime, mentre le molecole più piccole viaggiano più lentamente ed eluiscono dopo, in ordine decrescente della loro dimensione in soluzione. Da qui la semplice regola: le grandi escono per prime.
Da quando è possibile correlare il peso molecolare di un polimero con le sue dimensioni in soluzione, la GPC ha rivoluzionato la misurazione della distribuzione del peso molecolare dei polimeri che, a sua volta, determina le caratteristiche fisiche che possono migliorare o diminuire la lavorazione, la qualità e le prestazioni dei polimeri.