Hög prevalens av humant papillomvirus vid kolorektal cancer hos latinamerikaner: A Case-Control Study

Abstract

Den roll som Human Papillomavirus (HPV) spelar i kolorektal karcinogenes är fortfarande svårdefinierad. Baserat på den höga incidensen av HPV-associerade maligniteter bland spansktalande puertoricaner syftade denna studie till att bedöma prevalensen av HPV-infektion och viral integration i kolorektala vävnader för att utvärdera dess förmodade roll i kolorektal cancer (CRC). I denna fall-kontrollstudie bedömdes förekomsten av HPV-infektion i CRC (fall n = 45) och normal tjocktarmsslemhinna från cancerfria personer (kontroller n = 36) med hjälp av en nested PCR-strategi. HPV-16-genotypning utfördes i HPV-positiva vävnader och HPV-16-genomens fysiska status fastställdes genom E2-detektion. HPV påvisades hos 19 av 45 (42,2 %) CRC-fall (medelålder 61,1 ± 10,7 år, 24 män) och hos 1 av 36 (2,8 %) kontroller (medelålder 60,9 ± 9,6 år, 24 män) med en OR = 25,58 (95 % CI 3,21 till 203,49). HPV-16 påvisades i 63,2 % av de HPV-positiva kolorektala tumörerna; genomintegration observerades i alla HPV-16-positiva fall. Detta är den första rapporten som visar den höga prevalensen av HPV-infektioner i karibiska spansktalande kolorektala tumörer. Trots bevis för HPV-integration i värdgenomet är ytterligare mekanistisk analys som undersöker HPV:s onkoproteinuttryck och dessa onkoproteins förmodade roll i kolorektal karcinogenes motiverad.

1. Introduktion

Infektioner med humant papillomvirus (HPV) är de vanligaste sexuellt överförbara infektionerna i USA (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). HPV är epitelotropa, dubbelsträngade DNA-virus som infekterar skivepitelet i slemhinneceller i huden. Virusförökningen sker i cellkärnorna och är nära kopplad till cellens differentieringstillstånd. Det finns långt över 100 genotyper av HPV. Typerna 6, 11, 40 och 42 är ofta förknippade med godartade lesioner och klassificeras som lågrisktyper. HPV-16, HPV-18, HPV-31 och HPV-45 anses ha hög onkogen potential och betecknas som högrisktyper . HPV har identifierats som en orsak till livmoderhalscancer , vaginalcancer , analcancer , muncancer och peniscancer . Studier har också visat på starka samband mellan HPV och utvecklingen av många typer av cancer, t.ex. i matstrupen, svalget och struphuvudet. HPV-infektionens förmodade roll i kolorektal karcinogenes har dock inte klarlagts ordentligt och är fortfarande kontroversiell.

Patogenesen för kolorektal cancer har blivit bättre förstådd på molekylär nivå, men etiologin för kolorektal cancer är fortfarande ofullständigt förstådd. Under det senaste decenniet har flera studier föreslagit att HPV kan ha en roll i kolorektal karcinogenes . Påvisande av HPV i vävnad från tjocktarmen har lett till en mängd olika arbeten där man föreslår ett orsakssamband mellan HPV och koloncancer. Förekomsten av HPV i kolonvävnad är fortfarande ett mycket kontroversiellt diskussionsämne på grund av inkonsekvenser i resultatens reproducerbarhet. Eftersom integrering av HPV-genomet är nödvändig för att viruset ska kunna utöva sin cancerframkallande potential är en bedömning av virusgenomets fysiska status efter bekräftelse av HPV-infektion nödvändig för att fastställa ett orsakssamband. Inaktivering av E2-genen genom genomisk integration främjar uttrycket av onkoproteinerna E6 och E7, som motverkar funktionen hos p53 respektive pRB . Den resulterande nedbrytningen av p53 och pRB som förmedlas av dessa onkoproteiner underlättar viral DNA-proliferation i värden och leder till neoplasi genom mekanismer som är väl beskrivna i litteraturen .

CRC är ansvarig för cirka 694 000 dödsfall i världen . I USA är CRC den tredje vanligaste cancerdiagnosen och den tredje vanligaste dödsorsaken till cancer. I Puerto Rico (PR) är CRC den näst vanligaste diagnosen och den främsta dödsorsaken till cancer bland män och kvinnor . En hög prevalens av HPV-relaterad cancer och en hög prevalens av HPV i anogenitala prover har rapporterats bland puertoricanska män och kvinnor . Seroprevalensen av HPV-16 rapporterades vara 11,3 % i ett befolkningsbaserat urval av vuxna i PR , vilket liknar den som rapporterats i USA (11,5 %) . Med tanke på den höga dödligheten i CRC och den höga förekomsten av HPV-relaterad sjuklighet i PR var det övergripande syftet med denna fall-kontrollstudie att utvärdera sambandet mellan CRC och HPV-infektion i prover från spansktalande puertoricaner.

2. Metoder

2.1. Etiskt uttalande

Denna studie godkändes av University of Puerto Rico Medical Sciences Campus IRB (#A7330109). Alla förfaranden var i enlighet med IRB:s etiska normer.

2.2. Rekrytering av försökspersoner och insamling av prover

Fall och kontroller rekryterades efter varandra med hjälp av bekvämlighetsurval och var frekvensmatchade med avseende på kön och ålder. Deltagare i studien som var 21 år eller äldre rekryterades när de besökte Puerto Rico Medical Centers anläggningar för koloskopi på grund av rutinmässig screening, symtom och/eller remisser från gastroenterologer och kolorektalkirurger. Syftet med studien förklarades och alla studiedeltagare gav informerat samtycke innan de inkluderades. Alla deltagare som ingick i denna analys var latinamerikaner. Att vara spansktalande definierades genom deltagarens självrapporterade härkomst eller födelseort. Alla kontrollpersoner som ingick i denna studie hade normala resultat i sin koloskopi. Individer med CRC hade en diagnos av adenokarcinom bekräftad genom histopatologi. Personer med ärftliga cancersyndrom och inflammatoriska tarmsjukdomar uteslöts.

Färsk fryst vävnad erhölls från 45 icke-familjära, sporadiska CRC-patienter (fall) och 36 cancerfria personer (kontroller). Vävnader togs från CRC-patienter under tumörresektionskirurgi. Anal- eller perianala tumörer och vävnadsprover från individer som rapporterats vara hiv-positiva exkluderades. Tumörens placering klassificerades som proximal (från cecum till distala tvärkolon), distal (från mjältböjningen till sigmoidkolon) eller rektum (de sista 20 cm av kolon). Kontrollkolorektala vävnadsbiopsier togs från det distala kolonet under rutinmässiga koloskopier.

Med hjälp av frågeformuläret Collaborative Family Registries’ Colorectal Cancer Risk Factor Questionnaire (http://coloncfr.org/) samlades kliniska och sociodemografiska data in från varje patient, bland annat kön, livsstil, sjukdomshistoria och familjehistoria med cancer. De sociodemografiska och kliniska egenskaper som analyserades i studien var kön (man kontra kvinna), medianålder (<61 år kontra ≥61 år), typ 2 DM-diagnos (ja kontra nej), familjehistoria av någon cancer (ja kontra nej) och familjehistoria av CRC (ja kontra nej). Familjehistoria definieras som att ha en släkting av första, andra eller tredje graden med cancer. De livsstilsegenskaper som analyserades i denna studie var alkoholkonsumtion (någonsin kontra aldrig) och rökstatus (någonsin kontra aldrig).

2.3. DNA-extraktion

Genomiskt DNA (gDNA) extraherades från ≈100 mg vävnad med hjälp av DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) enligt tillverkarens instruktioner. För kvalitetskontroll användes PCR-amplifiering av -actin-genen för att bedöma gDNA-integriteten; prover från vilka -actin inte kunde amplifieras uteslöts från studien.

Följande standardiserade försiktighetsåtgärder vidtogs för att minimera korskontaminering från prov till prov: Alla instrument och arbetsbänkar torkades av med DNAZap (Ambion, Foster City, CA), följt av 10 % blekmedel och 70 % ETOH före provmanipulering. Nya, sterila blad användes för varje prov. Vävnadsbearbetning och nukleotidutvinning begränsades till högst 10 prover per dag. Ungefär 100 mg av varje prov kodades slumpmässigt på ett blindat sätt och användes för ytterligare analyser.

2.4. HPV-detektion och genotypning

Detektion av HPV-dna från människa utfördes via en nested PCR-strategi med PGMY09/PGMY11 som yttre primers och GP5+/GP6+ som inre primers . Dessa primers amplifierar en HPV L1 konsensusregion som upptäcker mer än 25 HPV-typer. Varje reaktion utfördes i en total volym på 25 μL som innehöll 200 ng gDNA, 12,5 μL Bullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO) och 100 nmol/L poolade PGMY09/11 primers. Följande förhållanden användes: 15 minuter vid 95°C, följt av 35 cykler om 60 sekunder vardera vid 94°C, 60°C och 72°C, med en slutlig förlängning på 10 minuter vid 72°C. Två mikroliter av den första PCR-reaktionen användes som mall för den nested PCR. Förhållandena för den nested PCR-reaktionen var identiska med den första PCR-reaktionen med undantag för glödgningstemperaturen som var 52°C. Amplifierade produkter elektroforeserades och analyserades med hjälp av en ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA). Detektion av pHPV-16 renat plasmid-DNA (ATCC 45113D) användes som positiv kontroll och vatten som negativ kontroll.

HPV-16 DNA-genotypning utfördes med typspecifika primers riktade mot HPV-16 E6 . HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCACAAAAGAGAGAAC-3′) och Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTCTGGTTGC-3′) primers användes för den första körningen, med samma PCR-förhållanden som beskrivits ovan med undantag för glödgningstemperaturen som var 68 °C. Villkoren för nested PCR med primrarna Pr106: 5′-GTTTCTCAGGACCCACACAGGAGC-3′ och Pr562: 5′-GTACTCACACC CC/TGATTACAGCAGCTGGGTTT C-3′ var desamma med undantag för glödgningstemperaturen som var 60 °C. Detektion av pHPV-16 renat plasmid-DNA (ATCC 45113D) och vatten användes som positiv respektive negativ kontroll. Amplikonerna elektroforeserades och visualiserades enligt beskrivningen. Tio procent av proverna som testades med nested PCR validerades och bekräftades externt vid AIDS Research Program Laboratory vid Ponce School of Medicine & Health Sciences (Ponce, PR) med hjälp av INNO-LiPA HPV Genotyping Extra kit (Fujirebio, Gent, Belgien).

2.5. HPV:s fysiska status

Den fysiska statusen hos HPV-16-genomet fastställdes genom att undersöka E2-sekvensintegriteten med hjälp av en tidigare beskriven nested PCR-strategi . Alla tumörer med HPV-16 DNA analyserades (). Nested PCR-analysen utfördes med hjälp av 2 uppsättningar av specifika HPV-16-primrar som omfattade 2 framåtriktade primrar, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) och Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′), och två omvända primers, Pr128 (5′-GTCGCTCCTCTGTGGGTCCTG-3′) och Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGC-3′). Båda PCR:erna utfördes under samma förhållanden som tidigare beskrivits med undantag för glödgningstemperaturen som var 60 °C. Amplikonerna analyserades enligt beskrivningen. DNA extraherat från CaSki (CRL-1550) och SiHa (HTB-35) humana livmoderhalscellinjer användes som positiva kontroller. Avsaknaden av PCR-produkt tolkades som E2-sekvensavbrott och integration av viralt DNA i värdgenomet. Närvaron av E2-amplikoner tyder på att det finns episomala HPV-16-genom.

2.6. Statistisk analys

Sociodemografiska, kliniska och livsstilsegenskaper hos fall och kontroller beskrevs med hjälp av frekvensfördelningar för kategoriska variabler och sammanfattande mått för kvantitativa variabler. Tvåsidiga test användes för att jämföra undersökningsgrupper: chi-två-test eller Fishers exakta test användes för kategoriska variabler och Students -test eller Mann-Whitney-test för att jämföra kvantitativa variabler. Ovillkorliga logistiska regressionsmodeller användes för att uppskatta OR med 95 % konfidens för CRC i förhållande till HPV-status och andra variabler. Statistiska analyser utfördes med hjälp av SPSS 17.0 (SPSS Inc.) och Epi InfoTM 7 (CDC).

3. Resultat

3.1. Sociodemografiska, livsstilsrelaterade och kliniska egenskaper hos studiedeltagarna

De demografiska och kliniska egenskaperna hos studiepopulationen (; 45 CRC-fall och 36 kontroller) presenteras i tabell 1. Medelåldern för CRC-fallen var 61,1 år (varierade från 38 till 86 år; 24 var män). I kontrollgruppen var medelåldern 60,9 år (från 42 till 85 år; 15 var män). Jämfört med kontrollgrupperna var det mer sannolikt att CRC-fallen rapporterade en familjehistoria av CRC (OR 0,29; 95 % 0,10-0,80). När det gäller åldern på de familjemedlemmar med CRC som angavs av försökspersonen var medianåldern för CRC-diagnosen hos släktingar till fall och kontroller 60 år. Inga statistiskt signifikanta samband hittades när man jämförde fall och kontroller med släktingar som diagnostiserats med CRC vid ≥60 år jämfört med <60 år. Inga andra signifikanta associationer hittades.

3.2. HPV DNA-detektion

En signifikant skillnad i prevalensen av HPV-infektion observerades när man jämförde vävnader från kolorektala tumörer och normala slemhinnor från kontroller. HPV-DNA påvisades i 19 av de 45 (42,2 %) proverna från CRC och i 1 av de 36 (2,8 %) undersökta kontrollproverna (figur 1). HPV-infektion var positivt förknippad med CRC (OR 25,58; 95 % CI 3,22 till 203,49) (tabell 2). Sambandet mellan HPV-positiv status och CRC observerades i alla anatomiska regioner i tjocktarmen.

Figur 1

HPV-detektionsassay. Figuren visar den elektrofotografiska profilen för 12 representativa fall som undersökts med nested PCR för detektion av HPV L1. Fall 2, 4, 5, 6, 8 och 10 är positiva, vilket framgår av förekomsten av den amplikon som genereras av primerparet GP 5+/6+. Lane M är den molekylära storleksmarkören; Lane 13 och 14 var HPV-positiva respektive vattenkontroller.

3.3. Sociodemografiska, livsstilsrelaterade och klinikpatologiska egenskaper hos HPV-positiva fall

Medelåldern för de HPV-positiva CRC-fallen var 60,3 år (varierade från 45 till 86; 9 var män). Inga signifikanta samband hittades mellan HPV-positiv status och följande: kön, ålder, användning av tobak eller alkohol, diabeteshistoria, familjehistoria av någon cancer eller familjehistoria av CRC (tabell 3). Inga signifikanta samband observerades mellan HPV-status och histologisk differentiering, tumörstadium eller lokalisering (tabell 4).

3.4. HPV-16-genotypning och bedömning av viral fysisk status

HPV-16 påvisades i 12 av de 19 HPV-positiva CRC-proverna (63,2 %); de återstående 7 (36,8 %) motsvarade andra HPV-genotyper (icke-typade). HPV-16 påvisades inte i det HPV-positiva kontrollprovet. Fördelningen av HPV-16-positiva tumörer med avseende på tumörlokalisering var följande: 33,3 % (4 av 12) av proverna påträffades i proximala kolon (cecum, ascenderande kolon och tvärgående kolon), 50,0 % (6 av 12) påträffades i distala kolon (mjältböjning, nedåtgående kolon och sigmoidkolon) och 16,7 % (2 av 12) påträffades i rektum. För icke-HPV-16-tumörer fanns 2 av 7 (28,6 %) i det distala kolonet och av 5 av 7 (71,43 %) i rektum. Den fysiska statusen för HPV-16-DNA i CRC-vävnader fastställdes genom detektion av HPV-16 E2. Den amplikon som motsvarar den intakta E2 upptäcktes inte i något av de HPV-16-positiva fallen, vilket tyder på att HPV-16-genomet var integrerat.

4. Diskussion och slutsatser

HPV har påvisats i kolorektala tumörer . HPV:s roll i kolorektal karcinogenes har dock inte klarlagts och ämnet är fortfarande kontroversiellt. I den aktuella undersökningen rapporterar vi en rigorös utvärdering av HPV-infektioner i kolorektala vävnader (CRC-fall och kontroller av normala slemhinnor) från en välkaraktäriserad spansktalande befolkning som rapporteras ha en hög incidens av HPV-associerade maligniteter och en hög CRC-dödlighet . HPV-16-genotypning och HPV-16-genomens fysiska status bedömdes också.

En hög prevalens av HPV-infektion (42,2 %) upptäcktes i de analyserade tumörvävnaderna. Endast 1 av de 36 (2,8 %) kontrollproverna var positiv för en icke-HPV-16-typ. Prevalensen av HPV-infektioner i kolorektala tumörer som hittades i vår kohort är jämförbar med procentsatser som tidigare rapporterats i studier från olika länder med olika experimentella metoder . Immunohistokemisk analys av formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsprover från individer i USA (; 30 kontroller, 30 adenom och 43 CRC) påvisade HPV-DNA i 27 % respektive 69 % av adenomen och CRC . HPV-typspecifika PCR-analyser av DNA från FFPE-prover från kinesiska individer påvisade HPV i 29 % av adenomen () och i 53 % av CRC ( . Med hjälp av samma nested PCR-strategi som användes i den här studien i kombination med in situ PCR påvisade en annan studie HPV DNA i 51 % av CRC-proverna () och inte i kontrollproverna () från individer i USA . I andra studier som använde samma nested PCR-strategi med CRC-prover från argentinska individer upptäcktes HPV i 44 % av CRC-proverna () . Pérez et al. (2005) rapporterade dock att HPV fanns i 33 % av de studerade icke-neoplastiska kolorektala vävnaderna ( . Däremot har flera studier inte kunnat påvisa HPV och har föreslagit att HPV-infektion inte är en riskfaktor för CRC .

HPV-16 är den vanligaste högrisktypen i Amerika . HPV-16 har också rapporterats vara mycket vanligt förekommande i HPV-associerade maligniteter i PR såsom huvud- och halscancer och livmoderhalscancer . I vår studie var HPV-16 den vanligaste högrisk-HPV-typen som upptäcktes; HPV-16 fanns i 63,2 % av de HPV-positiva CRC-proverna (12 av 19), vilket är jämförbart med vissa tidigare rapporter där HPV-16 var den vanligaste högrisk-HPV-typen som upptäcktes. På samma sätt visade analysen av HPV-positiva CRC-prover med hjälp av en PCR-baserad HPV-16-genotypningsmetod att det var den mest frekvent påvisade virustypen, som förekom i 41 av de 60 fallen (68,3 %) . HPV-16-genotypning med hjälp av samma primerpar som användes i denna studie påvisade HPV-16 i 36 % av CRC-proverna () . Med hjälp av icke-PCR-baserade HPV-16 genotypningstekniker har HPV-16 hittats i 16-94 % av HPV-positiva CRC-prover .

Diskrepanserna i litteraturen som rapporterar om detektion av HPV och HPV-16 i kolorektala tumörer kan tillskrivas metodologiska skillnader, bland annat studiedesign, typ av vävnadsprov, provstorlek, provinsamling och skillnader i känsligheten hos den HPV-detektions- eller genotypningsteknik som används. Frysta vävnadsprover användes eftersom det extraherade DNA:t är av högre kvalitet jämfört med DNA från FFPE, som bryts ned . Fixeringsförfarandet bryter ned DNA till fragment <200 bp, vilket leder till minskad PCR-avkastning och oförmåga att amplifiera långa mål. Därför är DNA extraherat från FFPE inte optimalt för den nested PCR-strategi som används i våra analyser. Kombinationen PGMY/GP+ primeruppsättning amplifierar HPV L1 (450 bp). Denna primerkombination har visat sig vara mer typkänslig än primeruppsättningarna MY/GP+ och detekterar ett bredare spektrum av HPV-typer . Ytterligare skillnader i upptäckten av HPV i CRC har förknippats med regionala variationer i prevalensen av HPV-infektion, som påverkas av försökspersonens ras/etniska och geografiska bakgrund . HPV-18 upptäcks till exempel oftast i CRC-fall från Asien och Europa .

HPV upptäcktes i CRC-vävnader i flera tumörprover från hela tjocktarmen. HPV påvisades i 21,05 % av proximala tumörer, 42,11 % av distala tumörer och 36,84 % av tumörerna i rektum. Den breda anatomiska spridningen av HPV-infektioner i CRC-tumörvävnad innebär att HPV-infektion i CRC inte är ett resultat av en retrograd virusöverföring från det anogenitala området. Med tanke på dessa resultat kan vi inte utesluta möjligheten av hematologisk spridning, vilket Bodaghi et al. föreslagit . Det finns bevis för HPV-infektioner hos spädbarn och kvinnliga universitetsstudenter som aldrig haft penetrerande sex, vilket stöder att HPV-överföring via andra icke-sexuella vägar kan förekomma . Även om HPV är en sexuellt överförbar sjukdom samlade vi inte in information om sexuellt beteende, vilket skulle ha gjort det möjligt för oss att bedöma om det finns något samband mellan CRC och sexuellt beteende.

Virusintegration i värdgenomet är ett kritiskt steg i livmoderhalscancerogenesen. Integration av HPV i värdgenomet har rapporterats i cirka 90 % av livmoderhalscancer. Dessa fall visar uttryck av de virala onkogenerna E6 och E7 . HPV:s fysiska status kan påvisas genom avsaknad av en PCR-produkt eftersom den öppna läsramen E2 bryts när HPV integreras i värdgenomet . Potentiella begränsningar med denna metod kan vara följande: testet kan endast påvisa integrerat viralt DNA i avsaknad av episomalt HPV-DNA, det kan inte skilja mellan rena episomala och blandade former, och möjligheten av virusintegration utan att förlora E2-genfragmentet beaktas inte . I vår studie uppvisade dock alla HPV-16-positiva fall som testades integration, vilket utesluter förekomsten av episomala genomer. Den höga andelen HPV-16-genomintegration i värdgenomet stöder möjligheten att HPV kan ha en roll i kolorektal karcinogenes. Våra resultat, även om de är uppmuntrande, måste tolkas med försiktighet. Trots den höga prevalensen av infektion i kolorektala tumörer med en högrisk HPV-typ (HPV-16) och bevis för viral genomintegration måste framtida studier bedöma om HPV-infektionerna är aktiva och om onkoproteinerna E6 och E7 uttrycks för att bidra till och/eller ha en kausal roll i kolorektal karcinogenes.

Vår studie har en relativt liten urvalsstorlek, vilket kan vara en begränsning för stratifierade och begränsade analyser. Dessa kan resultera i vissa oprecisa uppskattningar (vilket framgår av de breda 95-procentiga konfidensintervallen). Storleken på de observerade oddskvoterna för sambandet mellan HPV och CRC är dock mycket hög och det är osannolikt att den beror på ett statistiskt fel av typ I. De uppgifter som genererats i denna studie i kombination med rapporter i litteraturen är ännu inte tillräckliga för att dra slutsatsen att HPV är en orsak till CRC enligt Bradford Hills kriterier för orsakssamband . Fem av de nio postulerade kriterierna är uppfyllda. (1) Styrka: Starka statistiskt signifikanta samband har rapporterats i denna studie och i litteraturen . (2) Konsekvens: HPV har påvisats i CRC i andra studier med samma metodik . (3) Plausibilitet: HPV integreras i värdgenomet och uttrycker onkogena proteiner som är kända för att främja karcinogenes . (4) Analogi: HPV med hög risk, t.ex. HPV-16, har en kausal roll i andra cancerformer, t.ex. livmoderhalscancer . (5) Tidsmässighet: HPV har också påvisats i adenom, CRC-prekursorförändringar . Ytterligare longitudinella studier som utvärderar HPV:s roll i kolorektal karcinogenes behövs för att fullt ut stödja konsistens- och tidsmässighetskriteriet. Sammanfattningsvis rapporterar denna studie en hög prevalens av HPV-infektion, en hög prevalens av HPV-16 (en högrisktyp) och integrering av HPV-16-genomet i kolorektal tumörvävnad från karibiska latinamerikaner. Ytterligare analyser är motiverade för att fastställa ett orsakssamband mellan HPV och CRC.

Intressekonflikter

Författarna förklarade att det inte finns några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta projekt stöddes av RCMI Grant G12MD007600 och Grant U54MD007587 från NIMHD. Ytterligare stöd tillhandahölls av bidrag R21CA167220 och U54CA096297 från NCI. Författarna vill tacka Ana Patricia Ortiz för att hon kritiskt granskat denna artikel.