ヒスパニックの大腸がんにおけるヒトパピローマウイルスの高い有病率。 A Case-Control Study

Abstract

大腸発癌におけるHuman Papillomavirus（HPV）の役割は依然として不明である． プエルトリコのヒスパニック系住民のHPV関連悪性腫瘍の高い発生率に基づき，本研究では大腸癌（CRC）におけるHPVの推定的役割を評価するために，大腸組織におけるHPV感染およびウイルスの組み込みの有病率を評価することを目的とした。 この症例対照研究では、CRC（症例n＝45）および非がん患者の正常結腸粘膜（対照n＝36）におけるHPV感染の有病率をnested PCR戦略により評価した。 HPV-16ゲノタイピングはHPV陽性組織で行い、HPV-16ゲノムの物理的状態はE2検出により決定した。 HPVは，CRC症例45例中19例（42.2％）（平均年齢61.1±10.7歳，男性24例）および対照者36例中1例（2.8％）（平均年齢60.9±9.6歳，男性24例）で検出され，OR = 25.58（95％ CI 3.21～203.49） と なった． HPV-16はHPV陽性大腸腫瘍の63.2％に検出され，全陽性例でゲノムの統合が観察された。 本論文は，カリブ海地域のヒスパニック系大腸腫瘍におけるHPV感染の高率を示した最初の報告である． HPVの宿主ゲノムへの組み込みが確認されたが，HPVのオンコプロテインの発現と大腸発癌におけるこれらのオンコプロテインの推定的役割について，さらなる機序の解析が必要である

1. はじめに

ヒトパピローマウイルス（HPV）感染は，米国（US）で最も一般的な性感染症である（http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm）。 HPVは上皮向性の二本鎖DNAウイルスで、皮膚の粘膜細胞の扁平上皮に感染する。 ウイルスの増殖は細胞核で起こり、細胞の分化状態と密接に関係しています。 HPVには100をはるかに超える遺伝子型が存在する。 6型、11型、40型、42型は、一般に良性病変に関連し、低リスク型に分類される。 HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-45は発がん性が高いとされ、高リスク型と呼ばれる。 HPVは、子宮頸がん、膣がん、肛門がん、口腔がん、陰茎がんの原因物質として同定されています。 また、食道、咽頭、喉頭など多くの種類の癌の発生とHPVとの間に強い相関関係があることが研究により示されています。 しかし、大腸発がんにおけるHPV感染の役割はまだ十分に解明されておらず、論争の的となっている。

CRCの病因は分子レベルでより理解されてきているが、CRCの病因はまだ不完全にしか解明されていない。 この10年間で、いくつかの研究によりHPVが大腸発癌に関与している可能性が示唆されている 。 大腸組織における HPV の検出は、HPV と CRC の因果関係を示唆する様々な研究につながっている。 大腸組織における HPV の存在は、結果の再現性に矛盾があるため、依然として非常に議論の多い話題である。 HPVが発がん性を発揮するためには、HPVゲノムの集積が必要であり、HPV感染確認後のウイルスゲノムの物理的状態を評価することは、因果関係を立証するために不可欠である。 ゲノム統合によるE2遺伝子の不活性化は、E6およびE7というオンコプロテインの発現を促進し、それぞれp53およびpRBの機能を拮抗させる。 これらのオンコプロテインによってもたらされる p53 および pRB の分解は、宿主内でのウイルスの DNA 増殖を促進し、文献によく記載されているメカニズムによって新生物につながります。 米国では、CRC は 3 番目に多く診断されるがんであり、がんによる死亡の第 3 位の原因となっています。 プエルトリコ（PR）では、CRCは男女ともに2番目に多く診断され、がんによる死亡の主な原因となっています。 HPV関連癌の高い有病率と肛門性器サンプルにおけるHPVの高い有病率が、プエルトリコの男女で報告されている. HPV-16 の血清有病率は、プエルトリコの成人の人口ベースのサンプルで 11.3% と報告されており、これは米国での報告（11.5%）と同様である。 このように、プエルトリコではCRCの死亡率が高く、HPV関連疾患の発生率が高いことから、本ケースコントロール研究の全体的な目的は、プエルトリコのヒスパニック系住民のサンプルにおけるCRCとHPV感染の関連性を評価することであった

2. 方法

2.1. 倫理規定

本研究はプエルトリコ大学医学部キャンパスのIRB（#A7330109）により承認された。 すべての手続きはIRBの倫理基準に則って行われた。 被験者の募集とサンプルの取得

症例と対照は、コンビニエンスサンプリングを用いて連続的に募集し、性別と年齢で頻度を一致させた。 21歳以上の研究参加者は、定期的なスクリーニング、症状、および/または胃腸科医や大腸外科医からの紹介により、プエルトリコ医療センター施設を訪れて大腸内視鏡検査を受けた際に募集された。 本研究の目的を説明し、参加者全員が参加に先立ちインフォームドコンセントを行った。 この分析に含まれる参加者はすべてヒスパニック系であった。 ヒスパニックであることは、参加者が自己申告した遺産または出生地によって定義された。 本研究に参加した対照者は全員、大腸内視鏡検査で正常な結果を得ていた。 CRCの患者は、病理組織学的に腺癌と診断された者であった。

非家族性の散発性CRC患者（症例）45名と癌でない個人（対照）36名から新鮮な凍結組織を入手した。 組織はCRC患者から腫瘍切除手術中に採取された。 肛門または肛門周囲腫瘍、およびHIV陽性と報告された人からの組織サンプルは除外された。 腫瘍の位置は、近位（盲腸から遠位横行結腸まで）、遠位（脾弯曲からS状結腸まで）、または直腸（結腸の最後の20cm）に分類された。 対照の大腸組織生検は、定期的な大腸内視鏡検査時に遠位結腸から採取した。

共同家族登録の大腸がんリスク因子質問票（http://coloncfr.org/）を用いて、各患者から性別、ライフスタイル、病歴、がんの家族歴などの臨床・社会人口学的データを収集した。 本研究で分析した社会人口学的および臨床的特徴は、性別（男性対女性）、年齢の中央値（<61歳対≧61歳）、2型DM診断（あり対なし）、何らかのがんの家族歴（あり対なし）、CRCの家族歴（あり対なし）であった。 家族歴は、一、二、三親等以内の親族に癌患者がいることと定義した。 本研究で分析した生活習慣の特徴は、アルコール摂取（ある対ない）および喫煙状況（ある対ない）であった

2.3. DNA抽出

ゲノムDNA（gDNA）は、DNA Isolation Kit for Cells and Tissues（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を用いて、製造元の説明書に従って≈100 mgの組織から抽出された。 品質管理のため、-actin遺伝子のPCR増幅を行い、gDNAの完全性を評価した。-actinが増幅されないサンプルは、研究から除外した。

サンプル間の交差汚染を最小限に抑えるため、以下の標準的予防措置をとった。すべての機器と作業台は、DNAZap (Ambion, Foster City, CA) で拭き、サンプル操作の前に、10%漂白剤と70%ETOHを使った。 各サンプルには新しい滅菌済みブレードを使用した。 組織処理とヌクレオチド抽出は、1日あたり最大10サンプルに制限された。 各検体の約100 mgを盲検下で無作為にコード化し、さらなる分析に使用した

2.4. HPV検出とジェノタイピング

ヒトHPV DNA検出は、外側プライマーとしてPGMY09/PGMY11、内側プライマーとしてGP5+/GP6+を用いたnested PCR戦略によって実施された. これらのプライマーは、25種類以上のHPVを検出するHPV L1コンセンサス領域を増幅する。 各反応は、200 ngのgDNA、12.5 μLのBullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO) 、および100 nmol/LのプールしたPGMY09/11プライマーを含む総容量25 μLで実施された。 以下の条件で行った。 95℃で15分、94℃、60℃、72℃で60秒ずつ35サイクル、72℃で10分の最終伸長を行った。 最初のPCR反応物2マイクロリットルをnested PCRの鋳型として使用した。 ネステッドPCRの条件はアニーリング温度が52℃であることを除いて、最初の実行PCRと同じであった。 増幅産物はChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて電気泳動を行い、分析した。 pHPV-16 精製プラスミドDNA (ATCC 45113D) の検出をポジティブコントロール、水をネガティブコントロールとして用いた。

HPV-16 DNA genotypingは、HPV-16 E6 を標的とするタイプ特異的プライマーで実施した。 HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAAC-3′) and Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTGTTGC-3′) primers were used for the first run, with the same PCR conditions described above except of annealing temperature that was 68°C.HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTATGCACCAAAAGAGAAC-3′) and Pr625 (5′-CTGTCGGC-AGAG-AGGAC-3) primers had the first run. プライマーPr106: 5′-GTTTCAGGACCCACAGGAGC-3′ および Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGGTTT C-3′ によるネステッドPCRの条件は、アニーリング温度が60℃であることを除いて同じであった。 陽性対照としてpHPV-16精製プラスミドDNA（ATCC 45113D）の検出を、陰性対照として水をそれぞれ使用した。 アンプリコンは、記述されたように電気泳動され、可視化された。 nested PCRで検査したサンプルの10％は、INNO-LiPA HPV Genotyping Extra kit (Fujirebio, Gent, Belgium) を用いてPonce School of Medicine & Health Sciences (Ponce, PR) のAIDS Research Program Laboratoryで外部から検証・確認した

2.5. HPVの物理的状態

HPV-16ゲノムの物理的状態は、以前に記述したnested PCR戦略を用いてE2配列の完全性を調べることにより決定された。 HPV-16 DNAを保有するすべての腫瘍を分析した()。 Nested PCR解析は、2つのフォワードプライマーを含む2組の特異的HPV-16プライマーを用いて行われた。 Pr7581（5′-CACCTTGCCAACCATTCC-3′）およびPr7677（5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′）、ならびに2つのリバースプライマー、Pr128（5′-GTCGCTCCTGGTCCTG-3′）および Pr223（5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGC-3′） がある。 両PCRは、アニーリング温度が60℃であることを除いて、先に述べたのと同じ条件下で行った。 アンプリコンは記載されたように分析された。 CaSki（CRL-1550）およびSiHa（HTB-35）ヒト子宮頸部細胞株から抽出したDNAを陽性対照として使用した。 PCR産物がないことは、E2配列の破壊およびウイルスDNAの宿主ゲノムへの統合と解釈された。 E2アンプリコンの存在は、エピソーマルHPV-16ゲノムの存在を示す。

2.6. 統計解析＜1486＞＜8315＞症例と対照の社会人口学的、臨床的、およびライフスタイルの特徴は、カテゴリー変数については頻度分布、定量変数については要約尺度を用いて説明した。 両側検定が研究群の比較に用いられた。カテゴリー変数にはカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定が、定量変数の比較にはStudent -testまたはMann-Whitney検定が使用された。 無条件ロジスティック回帰モデルを用いて、HPVの状態およびその他の変数との関連におけるCRCの95％信頼区間でのORを推定した。 統計解析はSPSS 17.0（SPSS Inc.）とEpi InfoTM 7（CDC）を用いて行った。 結果＜3444＞＜8708＞3.1. 研究参加者の社会人口統計学的、ライフスタイル、および臨床歴の特徴

研究対象者（CRC45例およびコントロール36例）の人口統計学的および臨床的特徴を表1に示す。 CRC症例の平均年齢は61.1歳（38～86歳の範囲、24人が男性）であった。 対照群では、平均年齢は60.9歳（42歳から85歳の範囲、男性15人）であった。 対照群と比較して、CRC症例はCRCの家族歴を報告する傾向が強かった（OR 0.29；95％ 0.10-0.80）。 対象者が示したCRCの家族の年齢について、症例と対照の親族におけるCRC診断年齢の中央値は60歳であった。 CRCと診断された親族の年齢が60歳以上と<60歳の症例と対照を比較した場合、統計的に有意な関連は見られなかった。 その他の有意な関連は認められなかった。

3.2. HPV DNA検出

大腸腫瘍組織と対照者の正常粘膜を比較したところ、HPV感染の有病率に有意差が認められた。 HPV DNAは調査したCRC45検体中19検体（42.2％），対照群36検体中1検体（2.8％）で検出された（図1）。 HPV感染はCRCと正の相関があった（OR 25.58; 95% CI 3.22 to 203.49）、（表2）。 HPV陽性とCRCの関連は、大腸の解剖学的領域全体にわたって観察された。

3.3. HPV陽性例の社会人口統計学的，生活習慣学的，臨床病理学的特徴

HPV陽性CRC例の平均年齢は60.3歳（45～86歳の範囲，9人が男性）であった。 HPV陽性と性別，年齢，タバコやアルコールの使用，糖尿病の既往，何らかの癌の家族歴，CRCの家族歴との間に有意な関連は認められなかった（表3）。 HPVの有無と組織学的分化度、腫瘍のステージ、部位との間に有意な関連は認められなかった（表4）。

3.4. HPV-16 Genotyping and Assessment of Viral Physical Status

HPV-16はHPV陽性CRC19検体中12検体（63.2%）で検出され、残りの7検体（36.8%）は他のHPV遺伝子型（non-type）に相当するものであった。 HPV-16はHPV陽性の対照試料では検出されなかった。 HPV-16陽性腫瘍の腫瘍部位に関する分布は以下の通りであった。 近位側結腸（盲腸，上行結腸，横行結腸）に33.3％（12例中4例），遠位側結腸（脾弯曲，下行結腸，S状結腸）に50.0％（同6例），直腸に16.7％（同2例）検出された． 非HPV-16腫瘍では，7例中2例（28.6％）が遠位結腸に，7例中5例（71.43％）が直腸に検出された。 CRC組織中のHPV-16 DNAの物理的状態は，HPV-16 E2の検出により判定した． HPV-16陽性例ではE2に相当するアンプリコンは検出されず，HPV-16ゲノムは統合されていることが示された。 議論と結論

HPV は大腸腫瘍で検出されている． しかし、大腸発癌におけるHPVの役割については解明されておらず、依然として議論の余地がある。 今回の調査では、HPV関連悪性腫瘍の発生率が高く、CRC死亡率も高いと報告されている特徴のあるヒスパニック系集団の大腸組織（CRC症例と正常粘膜対照）におけるHPV感染を厳密に評価したことを報告する。 HPV-16 genotypingとHPV-16ゲノムの物理的状態も評価した。

分析した腫瘍組織では高いHPV感染率（42.2％）が検出された。 対照試料36検体中1検体（2.8％）だけがHPV-16以外の型に陽性であった。 我々のコホートで発見された大腸腫瘍におけるHPV感染の有病率は、異なる実験的アプローチを用いた各国の研究でこれまでに報告された割合と同等である。 米国の個人から採取したホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルの免疫組織化学的解析（；対照30、腺腫30、CRC43）では、腺腫とCRCのそれぞれ27％と69％にHPV DNAが検出された。 中国人の FFPE サンプルから採取した DNA を HPV タイプ特異的 PCR で解析したところ、腺腫の 29% () と CRC の 53% () から HPV が検出された。 この研究で用いたのと同じネステッド PCR 戦略と in situ PCR を組み合わせた別の研究では、米国の個人の CRC サンプル () の 51% から HPV DNA を検出したが対照サンプル () からは検出されなかった . また、アルゼンチン人のCRC検体で同じnested PCR法を用いた研究では、CRC検体の44%にHPVが検出された() 。 しかし、Pérez ら (2005) は、調査した非腫瘍性大腸組織の 33% に HPV が存在すると報告している ( . 一方、いくつかの研究では HPV が検出されず、HPV 感染は CRC の危険因子ではないとしている

HPV-16 はアメリカ地域で最もよく見られる高リスク型である . HPV-16は頭頸部がんや子宮頸がんなどPRのHPV関連悪性腫瘍に高率に存在することも報告されている. HPV-16は、HPV陽性CRCサンプルの63.2％（19例中12例）で検出され、HPV-16が最も一般的な高リスク型HPVであった過去の報告と同等であった。 同様に，PCRベースのHPV-16ジェノタイピング法を用いたHPV陽性CRCサンプルの解析では，60例中41例（68.3％）で検出され，最も頻度の高いウイルス型であった． 本研究で用いたのと同じプライマーペアを用いたHPV-16 genotypingでは，CRC検体の36％からHPV-16が検出された（）． 非PCRベースのHPV-16 genotyping技術を用いると，HPV-16はHPV陽性CRCサンプルの16～94％に検出された。

大腸腫瘍におけるHPVおよびHPV-16の検出を報告する文献における矛盾は，研究デザイン，組織サンプルの種類，サンプルサイズ，サンプル収集，使用したHPV検出またはgenotyping技術の感度の違いなどの方法論の違いに起因していると思われる。 凍結組織試料を用いたのは、抽出された DNA が、劣化している FFPE からの DNA と比較して、優れた品質であるためである。 固定化処理によりDNAは<200 bpの断片に分解され、その結果、PCRの収量が減少し、長い標的を増幅することができない。 したがって、FFPEから抽出したDNAは、我々の解析で使用したnested PCR戦略には最適ではない。 PGMY/GP+プライマーセットの組み合わせは、HPV L1 (450 bp)を増幅する。 このプライマーの組み合わせは、MY/GP+プライマーセットよりも型感受性が高く、より広範囲のHPV型を検出することが判明している。 CRCにおけるHPVの検出におけるさらなる違いは、HPV感染の有病率における地域差と関連しており、これは被験者の人種／民族および地理的背景の影響を受けている。 例えば、HPV-18はアジアとヨーロッパのCRC症例で最も頻繁に検出される。

HPVはCRC組織において、大腸全体で得られた複数の腫瘍標本で検出された。 HPVは近位腫瘍の21.05％，遠位腫瘍の42.11％，直腸の腫瘍の36.84％に検出された。 CRC腫瘍組織におけるHPV感染の幅広い解剖学的分布は、CRCにおけるHPV感染が、肛門性器領域からの逆行性ウイルス感染の結果ではないことを示唆している。 これらの結果から，Bodaghiらが示唆したように，血液学的伝播の可能性を捨てることはできない． また、性交渉の経験のない幼児や女子大生にもHPV感染が確認されており、性交渉以外の経路でのHPV感染が存在する可能性があることを裏付けている …。 HPVは性感染症であるが、CRCと性行動の間に関連があるかどうかを評価できるはずの性行動情報を収集していない。

宿主ゲノムへのウイルス組み込みは、子宮頸がん発がんに重要なステップである。 HPVの宿主ゲノムへの組み込みは子宮頸癌の約90％において報告されている。 これらの症例では、E6およびE7ウイルス性癌遺伝子の発現が認められる。 HPVが宿主ゲノムに統合されるとE2オープンリーディングフレームが破壊されるため、HPVの物理的状態はPCR産物の欠如によって検出することができる 。 この方法による潜在的な限界は以下の通りである。 この方法では，エピソーム型HPV DNAが存在しない場合にのみ統合されたウイルスDNAを検出することができ，純粋なエピソーム型と混合型を識別することができず，E2遺伝子断片を失うことなくウイルスが統合する可能性は考慮されていない … しかし、我々の研究では、検査したHPV-16陽性例のすべてが統合を示し、エピソーマルゲノムの存在を否定することができた。 HPV-16 ゲノムが高い確率で宿主ゲノムに統合されたことは、HPV が大腸発がんに関与している可能性を支持するものである。 我々の結果は、有望ではあるが、慎重に解釈する必要がある。 大腸腫瘍における高リスクHPV型（HPV-16）の高い感染率とウイルスゲノム統合の証拠にもかかわらず，今後の研究では，HPV感染が活発であるかどうか，また，大腸発癌に寄与するためにオンコプロテインE6およびE7が発現しているかどうか，および，大腸発癌との因果関係を評価する必要がある

我々の研究は比較的サンプルサイズが小さく，層別および限定解析には限界がある可能性がある． その結果、（広い95％信頼区間によって証明されるように）いくつかの不正確な推定値がもたらされる可能性がある。 しかしながら、HPVとCRCの関連について観察されたオッズ比の大きさは非常に大きく、I型統計エラーに起因するものである可能性は低い。 本研究で得られたデータは、文献上の報告と合わせて、Bradford Hillの因果関係判定基準に従ってHPVがCRCの原因物質であると結論づけるにはまだ十分ではない。 9つの想定された基準のうち5つは満たされている。 (1) 強度：本研究および文献において、統計的に有意な強い関連が報告されている。 (2) 一貫性。 HPV は、同じ方法論を用いた他の研究でも CRC で検出されている . (3）妥当性：HPV は宿主ゲノムに組み込まれ、発がんを促進することが知られている発がん性タンパク質を発現する。 (4) 類似性：HPV-16 などの高リスク HPV は、子宮頸がんなどの他のがんにおいて因果関係がある。 (5) 時系列性：HPV は CRC 前駆病変である腺腫でも検出されている。 一貫性と時間性の基準を完全に支持するためには、大腸発がんにおける HPV の役割を評価する長 期的な研究を追加する必要がある。 結論として、本研究ではカリブ海系ヒスパニックの大腸腫瘍組織におけるHPV感染の高率、HPV-16（高リスク型）の高率、HPV-16ゲノムの集積を報告した。 HPVとCRCの因果関係を明らかにするためには、さらなる解析が必要である。

Conflict of Interests

著者らは、利害の対立がないことを宣言した。

Acknowledgements

このプロジェクトはNIMHDのRCMI Grant G12MD007600 および Grant U54MD007587 により支援されていた。 また、NCIからGrant R21CA167220およびU54CA096297による支援も受けた。 本稿を批評的に読んでくださったAna Patricia Ortiz博士に感謝する

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