High Prevalence of Human Papillomavirus in Colorectal Cancer in Hispanics: A Case-Control Study

Abstract

Rola wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) w kancerogenezie jelita grubego pozostaje nieuchwytna. W oparciu o wysoką częstość występowania nowotworów złośliwych związanych z HPV wśród Latynosów portorykańskich, niniejsze badanie miało na celu ocenę częstości występowania infekcji HPV i integracji wirusowej w tkankach jelita grubego w celu oceny jego domniemanej roli w raku jelita grubego (CRC). W tym badaniu kliniczno-kontrolnym oceniano częstość występowania infekcji HPV w CRC (przypadki n = 45) i w prawidłowej błonie śluzowej jelita grubego od osób wolnych od raka (kontrola n = 36), stosując strategię zagnieżdżonego PCR. Genotypowanie HPV-16 przeprowadzono w tkankach HPV-pozytywnych, a status fizyczny genomu HPV-16 określono na podstawie detekcji E2. HPV wykryto w 19 z 45 (42,2%) przypadków CRC (średni wiek 61,1 ± 10,7 lat, 24 mężczyzn) i w 1 z 36 (2,8%) grup kontrolnych (średni wiek 60,9 ± 9,6 lat, 24 mężczyzn) z OR = 25,58 (95% CI 3,21 do 203,49). HPV-16 wykryto w 63,2% HPV-dodatnich guzów jelita grubego; integrację genomu zaobserwowano we wszystkich przypadkach HPV-16 dodatnich. Jest to pierwsze doniesienie wskazujące na wysoką częstość występowania infekcji HPV w guzach jelita grubego u Latynosów karaibskich. Pomimo dowodów na integrację HPV z genomem gospodarza, uzasadnione są dalsze analizy mechanistyczne badające ekspresję onkoprotein HPV oraz przypuszczalną rolę tych onkoprotein w kancerogenezie jelita grubego.

1. Wprowadzenie

Zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) są najczęstszymi zakażeniami przenoszonymi drogą płciową w Stanach Zjednoczonych (USA) (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). Wirusy HPV są epiteliotropowymi, dwuniciowymi wirusami DNA, które zakażają nabłonek płaski komórek błony śluzowej skóry. Namnażanie się wirusów zachodzi w jądrach komórkowych i jest ściśle związane ze stanem zróżnicowania komórek. Istnieje ponad 100 genotypów wirusa HPV. Typy 6, 11, 40 i 42 są powszechnie związane z łagodnymi zmianami i są klasyfikowane jako typy niskiego ryzyka. HPV-16, HPV-18, HPV-31 i HPV-45 są uważane za posiadające wysoki potencjał onkogenny i określane są jako typy wysokiego ryzyka. HPV został zidentyfikowany jako czynnik sprawczy w raku szyjki macicy, pochwy, odbytu, jamy ustnej i prącia. Badania wykazały również silne korelacje między HPV a rozwojem wielu rodzajów nowotworów, takich jak przełyk, gardło i krtań. Jednak przypuszczalna rola infekcji HPV w kancerogenezie jelita grubego nie została właściwie wyjaśniona i nadal pozostaje kontrowersyjna.

Patogeneza CRC stała się lepiej poznana na poziomie molekularnym, jednak etiologia CRC jest nadal nie w pełni zrozumiała. W ostatniej dekadzie kilka badań sugerowało, że HPV może odgrywać rolę w kancerogenezie jelita grubego. Wykrycie wirusa HPV w tkance jelita grubego doprowadziło do powstania wielu prac sugerujących związek przyczynowy między HPV a CRC. Obecność HPV w tkance okrężnicy pozostaje wysoce kontrowersyjnym tematem dyskusji z powodu niespójności w powtarzalności wyników. Ponieważ integracja genomu HPV jest konieczna, aby wirus mógł wywierać swój potencjał rakotwórczy, ocena fizycznego statusu genomu wirusa po potwierdzeniu infekcji HPV jest niezbędna do ustalenia związku przyczynowego. Inaktywacja genu E2 poprzez integrację genomową promuje ekspresję onkoprotein E6 i E7, które antagonizują funkcje odpowiednio p53 i pRB. Wynikająca z tego degradacja p53 i pRB, w której pośredniczą te onkoproteiny, ułatwia proliferację wirusowego DNA w obrębie gospodarza i prowadzi do neoplazji za pomocą mechanizmów dobrze opisanych w literaturze.

CRC jest odpowiedzialny za około 694 000 zgonów na całym świecie. W USA CRC jest 3. najczęściej diagnozowanym nowotworem i 3. główną przyczyną zgonów z powodu raka. W Puerto Rico (PR), CRC jest 2. najczęściej diagnozowanym i wiodącą przyczyną zgonów z powodu raka wśród mężczyzn i kobiet. Wśród portorykańskich mężczyzn i kobiet odnotowano wysoką częstość występowania nowotworów związanych z HPV oraz wysoką częstość występowania HPV w próbkach anogenitalnych. Seroprewalencja HPV-16 wynosiła 11,3% w populacyjnej próbie dorosłych w Portoryko, co jest wartością podobną do tej odnotowanej w USA (11,5%). Tak więc, biorąc pod uwagę wysoki wskaźnik śmiertelności z powodu CRC i wysoką częstość występowania chorób związanych z HPV w PR, ogólnym celem tego badania kliniczno-kontrolnego była ocena związku między CRC a infekcją HPV w próbkach pochodzących od Latynosów z Portoryko.

2. Metody

2.1. Oświadczenie etyczne

Badanie to zostało zatwierdzone przez University of Puerto Rico Medical Sciences Campus IRB (#A7330109). Wszystkie procedury były zgodne z normami etycznymi IRB.

2.2. Rekrutacja podmiotów i pozyskiwanie próbek

Przypadki i kontrole były rekrutowane kolejno przy użyciu próbkowania dogodnego i były dopasowywane pod względem częstotliwości według płci i wieku. Uczestnicy badania w wieku 21 lat lub starsi byli rekrutowani, gdy odwiedzali placówki Puerto Rico Medical Center w celu wykonania kolonoskopii z powodu rutynowych badań przesiewowych, objawów i/lub skierowań od gastroenterologów i chirurgów kolorektalnych. Cel tego badania został wyjaśniony i wszyscy uczestnicy badania wyrazili świadomą zgodę przed włączeniem do badania. Wszyscy uczestnicy włączeni do tej analizy byli Latynosami. Bycie Latynosem było definiowane na podstawie deklarowanego przez uczestnika dziedzictwa lub miejsca urodzenia. Wszystkie osoby z grupy kontrolnej objęte tym badaniem miały prawidłowe wyniki kolonoskopii. Osoby z CRC miały rozpoznanie gruczolakoraka potwierdzone badaniem histopatologicznym. Wykluczono osoby z dziedzicznymi zespołami nowotworowymi i chorobami zapalnymi jelit.

Świeżo zamrożoną tkankę uzyskano od 45 nierodzinnych, sporadycznych pacjentów z CRC (przypadki) i 36 osób wolnych od raka (kontrole). Tkanki zostały pobrane od pacjentów z CRC podczas operacji resekcji guza. Wykluczono guzy odbytu lub okolicy odbytu oraz próbki tkanek od osób, które zgłosiły, że są HIV-pozytywne. Lokalizacja guza została sklasyfikowana jako proksymalna (od kątnicy do dystalnej części okrężnicy poprzecznej), dystalna (od zgięcia śledzionowego do esicy) lub odbytnica (ostatnie 20 cm okrężnicy). Kontrolne biopsje tkanki jelita grubego uzyskano z dystalnej części okrężnicy podczas rutynowych kolonoskopii.

Używając kwestionariusza czynników ryzyka raka jelita grubego Collaborative Family Registries’ (http://coloncfr.org/), zebrano dane kliniczne i socjodemograficzne od każdego pacjenta, w tym płeć, styl życia, historię medyczną i historię raka w rodzinie. Cechy socjodemograficzne i kliniczne analizowane w badaniu to płeć (mężczyźni versus kobiety), mediana wieku (<61 lat versus ≥61 lat), rozpoznanie DM typu 2 (tak versus nie), wywiad rodzinny w kierunku jakiegokolwiek nowotworu (tak versus nie) oraz wywiad rodzinny w kierunku CRC (tak versus nie). Wywiad rodzinny definiuje się jako występowanie raka u krewnego pierwszego, drugiego lub trzeciego stopnia. Cechy stylu życia, które były analizowane w tym badaniu to spożycie alkoholu (kiedykolwiek w porównaniu z nigdy) i status palenia (kiedykolwiek w porównaniu z nigdy).

2.3. Ekstrakcja DNA

Genomowe DNA (gDNA) ekstrahowano z ≈100 mg tkanki przy użyciu DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) zgodnie z instrukcjami producenta. Dla celów kontroli jakości, amplifikacja PCR genu -aktyny została użyta do oceny integralności gDNA; próbki, z których -aktyna nie mogła być amplifikowana, zostały wykluczone z badania.

Podjęto następujące standardowe środki ostrożności w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami: wszystkie instrumenty i stoły robocze zostały wytarte DNAZap (Ambion, Foster City, CA), a następnie 10% wybielaczem i 70% ETOH przed manipulacją próbką. Do każdej próbki używano nowych, sterylnych ostrzy. Przetwarzanie tkanek i ekstrakcja nukleotydów były ograniczone do maksymalnie 10 próbek dziennie. Około 100 mg każdej próbki zostało losowo zakodowane w sposób zaślepiony i użyte do dalszych analiz.

2.4. Wykrywanie HPV i genotypowanie

Wykrywanie DNA ludzkiego HPV przeprowadzono za pomocą zagnieżdżonej strategii PCR z użyciem PGMY09/PGMY11 jako starterów zewnętrznych i GP5+/GP6+ jako starterów wewnętrznych. Startery te amplifikują region konsensusu HPV L1, który wykrywa ponad 25 typów HPV. Każda reakcja była przeprowadzana w całkowitej objętości 25 μL zawierającej 200 ng gDNA, 12,5 μL Bullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO) i 100 nmol/L połączonych primerów PGMY09/11. Zastosowano następujące warunki: 15 minut w 95°C, a następnie 35 cykli po 60 sekund w 94°C, 60°C i 72°C, z końcowym przedłużeniem 10 minut w 72°C. Dwa mikrolitry pierwszej reakcji PCR zostały użyte jako szablon do zagnieżdżonej reakcji PCR. Warunki dla zagnieżdżonej reakcji PCR były identyczne jak dla pierwszej serii PCR, z wyjątkiem temperatury annealingu, która wynosiła 52°C. Produkty amplifikacji poddawano elektroforezie i analizowano przy użyciu aparatu ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA). Wykrywanie oczyszczonego plazmidowego DNA pHPV-16 (ATCC 45113D) było używane jako kontrola pozytywna, a woda jako kontrola negatywna.

Genotypowanie DNA HPV-16 przeprowadzono przy użyciu starterów specyficznych dla typu ukierunkowanych na HPV-16 E6 . Startery HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAGAAC-3′) i Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTGTTGTTGC-3′) zostały użyte w pierwszym przebiegu, z tymi samymi warunkami PCR opisanymi powyżej, z wyjątkiem temperatury annealingu, która wynosiła 68°C. Warunki dla nested PCR ze starterami Pr106: 5′-GTTTCAGGACCCACAGGAGC-3′ i Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGTTGTT C-3′ były takie same z wyjątkiem temperatury annealingu, która wynosiła 60°C. Wykrywanie oczyszczonego plazmidowego DNA pHPV-16 (ATCC 45113D) i woda były używane odpowiednio jako kontrola pozytywna i negatywna. Amplikony poddano elektroforezie i wizualizacji zgodnie z opisem. Dziesięć procent próbek badanych metodą nested PCR zostało zewnętrznie zwalidowanych i potwierdzonych w Laboratorium Programu Badań nad AIDS w Ponce School of Medicine & Health Sciences (Ponce, PR) przy użyciu zestawu INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Fujirebio, Gent, Belgia).

2.5. Status fizyczny HPV

Status fizyczny genomu HPV-16 został określony przez zbadanie integralności sekwencji E2 przy użyciu wcześniej opisanej strategii zagnieżdżonej PCR. Analizie poddano wszystkie guzy będące nosicielami DNA HPV-16 (). Analiza nested PCR została przeprowadzona przy użyciu 2 zestawów specyficznych starterów HPV-16, które zawierały 2 startery forward, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) i Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′), oraz 2 startery odwrotne, Pr128 (5′-GTCGCTCCTGTGTGTCCTG-3′) i Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGC-3′). Oba procesy PCR przeprowadzono w tych samych warunkach, które opisano wcześniej, z wyjątkiem temperatury annealingu, która wynosiła 60°C. Amplikony analizowano zgodnie z opisem. DNA ekstrahowane z ludzkich linii komórkowych szyjki macicy CaSki (CRL-1550) i SiHa (HTB-35) było używane jako kontrola pozytywna. Brak produktu PCR interpretowano jako przerwanie sekwencji E2 i integrację wirusowego DNA do genomu gospodarza. Obecność amplikonów E2 wskazuje na obecność episomalnych genomów HPV-16.

2.6. Analiza statystyczna

Charakterystyka socjodemograficzna, kliniczna i stylu życia w przypadkach i kontrolach została opisana przy użyciu rozkładów częstości dla zmiennych kategorycznych i miar podsumowujących dla zmiennych ilościowych. Do porównania grup badanych zastosowano testy dwustronne: test chi kwadrat lub dokładny test Fishera dla zmiennych kategorycznych oraz test Studenta lub test Manna-Whitneya do porównania zmiennych ilościowych. Bezwarunkowe modele regresji logistycznej wykorzystano do oszacowania OR z 95% pewnością wystąpienia CRC w zależności od statusu HPV i innych zmiennych. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programów SPSS 17.0 (SPSS Inc.) i Epi InfoTM 7 (CDC).

3. Wyniki

3.1. Sociodemographic, Lifestyle, and Clinical History Characteristics of Study Participants

Charakterystykę demograficzną i kliniczną badanej populacji (; 45 przypadków CRC i 36 kontroli) przedstawiono w tabeli 1. Średni wiek pacjentów z CRC wynosił 61,1 lat (od 38 do 86 lat; 24 mężczyzn). W grupie kontrolnej średni wiek wynosił 60,9 lat (od 42 do 85 lat; 15 mężczyzn). W porównaniu z grupą kontrolną, osoby z CRC częściej zgłaszały występowanie CRC w rodzinie (OR 0,29; 95% 0,10-0,80). Jeśli chodzi o wiek członków rodziny z CRC podany przez badanych, mediana wieku rozpoznania CRC u krewnych chorych i kontrolnych wynosiła 60 lat. Nie stwierdzono istotnych statystycznie związków, gdy porównywano przypadki i grupy kontrolne z krewnymi, u których rozpoznano CRC w wieku ≥60 lat vs. <60 lat. Nie stwierdzono innych istotnych skojarzeń.

3.2. Wykrywanie DNA HPV

Stwierdzono istotną różnicę w częstości występowania zakażenia HPV przy porównaniu tkanek nowotworów jelita grubego i prawidłowej błony śluzowej z grupy kontrolnej. DNA HPV wykryto w 19 z 45 (42,2%) próbek CRC i w 1 z 36 (2,8%) badanych próbek kontrolnych (Rycina 1). Zakażenie HPV było dodatnio związane z CRC (OR 25,58; 95% CI 3,22 do 203,49), (Tabela 2). Związek pomiędzy statusem HPV-dodatnim a CRC obserwowano we wszystkich regionach anatomicznych jelita grubego.

Rycina 1

Urządzenie do wykrywania HPV. Ten rysunek przedstawia profil elektrofotetyczny 12 reprezentatywnych przypadków badanych metodą PCR w celu wykrycia wirusa HPV L1. Przypadki 2, 4, 5, 6, 8 i 10 są pozytywne, jak wykazano przez obecność amplikonu generowanego przez parę primerów GP 5+/6+. Pas M to marker wielkości molekularnej; pasy 13 i 14 to odpowiednio kontrole HPV pozytywne i wodne.

3.3. Sociodemographic, Lifestyle, and Clinicopathological Characteristics of HPV-Positive Cases

Średni wiek HPV-dodatnich przypadków CRC wynosił 60,3 roku (od 45 do 86; 9 mężczyzn). Nie stwierdzono istotnych związków między HPV-dodatnim statusem a następującymi czynnikami: płcią, wiekiem, używaniem tytoniu lub alkoholu, cukrzycą w wywiadzie, występowaniem w rodzinie jakiegokolwiek nowotworu lub CRC w wywiadzie rodzinnym (Tabela 3). Nie zaobserwowano istotnych związków pomiędzy statusem HPV a zróżnicowaniem histologicznym, stadium zaawansowania nowotworu czy lokalizacją (Tabela 4).

3.4. HPV-16 Genotyping and Assessment of Viral Physical Status

HPV-16 wykryto w 12 z 19 HPV-dodatnich próbek CRC (63,2%); pozostałe 7 (36,8%) odpowiadało innym genotypom HPV (nontyped). HPV-16 nie został wykryty w HPV-dodatniej próbce kontrolnej. Rozkład guzów HPV-16 dodatnich pod względem lokalizacji był następujący: 33,3% (4 z 12) próbek znaleziono w proksymalnej części okrężnicy (kątnica, okrężnica wstępująca i okrężnica poprzeczna), 50,0% (6 z 12) znaleziono w dystalnej części okrężnicy (zgięcie śledzionowe, okrężnica zstępująca i okrężnica esowata), a 16,7% (2 z 12) wykryto w odbytnicy. W przypadku guzów nie-HPV-16 2 z 7 (28,6%) były zlokalizowane w okrężnicy dystalnej, a 5 z 7 (71,43%) w odbytnicy. Status fizyczny DNA HPV-16 w tkankach CRC określano poprzez wykrywanie HPV-16 E2. Amplikon odpowiadający nienaruszonemu E2 nie został wykryty w żadnym z pozytywnych przypadków HPV-16 wskazując, że genom HPV-16 był zintegrowany.

4. Dyskusja i wnioski

HPV został wykryty w guzach jelita grubego. Jednak rola HPV w kancerogenezie jelita grubego nie została wyjaśniona i temat ten pozostaje kontrowersyjny. W bieżącym badaniu przedstawiliśmy rygorystyczną ocenę infekcji HPV w tkankach jelita grubego (przypadki CRC i kontrole prawidłowej błony śluzowej) z dobrze scharakteryzowanej populacji latynoskiej, w której odnotowano wysoką częstość występowania nowotworów złośliwych związanych z HPV i wysoki wskaźnik śmiertelności z powodu CRC. Oceniono również genotypowanie HPV-16 oraz status fizyczny genomu HPV-16.

W analizowanych tkankach nowotworowych wykryto wysoką częstość występowania infekcji HPV (42,2%). Tylko 1 z 36 (2,8%) próbek kontrolnych była dodatnia dla typu nie-HPV-16. Częstość występowania infekcji HPV w guzach jelita grubego stwierdzona w naszej kohorcie jest porównywalna z odsetkami podawanymi wcześniej w badaniach z różnych krajów z zastosowaniem różnych podejść eksperymentalnych. Analiza immunohistochemiczna utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) próbek tkanek pochodzących od osób z USA (; 30 kontroli, 30 gruczolaków i 43 CRC) wykryła DNA HPV odpowiednio w 27% i 69% gruczolaków i CRC. Specyficzne dla HPV analizy PCR DNA z próbek FFPE od osób z Chin wykryły HPV w 29% gruczolaków () i w 53% CRC ( . Wykorzystując tę samą strategię PCR w połączeniu z PCR in situ, w innym badaniu wykryto DNA HPV w 51% próbek CRC (), a nie w próbkach kontrolnych () od osób z USA . Inne badania wykorzystujące tę samą strategię PCR z próbkami CRC od osób z Argentyny wykryły HPV w 44% próbek CRC () . Jednak Pérez i wsp. (2005) podali, że HPV był obecny w 33% badanych nienowotworowych tkanek jelita grubego ( . Z kolei w kilku badaniach nie wykryto HPV i zasugerowano, że infekcja HPV nie jest czynnikiem ryzyka dla CRC .

HPV-16 jest najczęściej występującym typem wysokiego ryzyka w obu Amerykach . HPV-16 został również zgłoszony jako wysoce rozpowszechniony w nowotworach złośliwych związanych z HPV w PR, takich jak rak głowy i szyi oraz szyjki macicy . W naszym badaniu HPV-16 był najczęściej wykrywanym typem HPV wysokiego ryzyka; HPV-16 był obecny w 63,2% HPV-dodatnich próbek CRC (12 z 19), co jest porównywalne z niektórymi wcześniejszymi doniesieniami, w których HPV-16 był najczęściej wykrywanym typem HPV wysokiego ryzyka. Podobnie, analiza próbek HPV-dodatnich CRC przy użyciu metody genotypowania HPV-16 opartej na PCR wykazała, że był to najczęściej wykrywany typ wirusa, obecny w 41 z 60 przypadków (68,3%). Genotypowanie HPV-16 przy użyciu tych samych par primerów, które zastosowano w tym badaniu, wykryło HPV-16 w 36% próbek CRC () . Wykorzystując techniki genotypowania HPV-16 oparte na nie-PCR, HPV-16 wykryto w 16-94% HPV-dodatnich próbek CRC .

Rozbieżności w literaturze zgłaszającej wykrywanie HPV i HPV-16 w guzach jelita grubego można przypisać różnicom metodologicznym, w tym projektowi badania, rodzajowi próbki tkanki, rozmiarowi próbki, gromadzeniu próbek i różnicom w czułości zastosowanej techniki wykrywania HPV lub genotypowania. Użyto mrożonych próbek tkanek, ponieważ wyekstrahowane DNA jest lepszej jakości w porównaniu z DNA z FFPE, które ulega degradacji. Procedura utrwalania degraduje DNA do fragmentów <200 bp, co skutkuje zmniejszoną wydajnością PCR i niemożnością amplifikacji długich celów. W związku z tym, DNA ekstrahowane z FFPE nie jest optymalne dla strategii zagnieżdżonej PCR stosowanej w naszych analizach. Kombinacja primerów PGMY/GP+ amplifikuje HPV L1 (450 bp). Ta kombinacja primerów okazała się bardziej wrażliwa na typ niż zestawy primerów MY/GP+, wykrywając szerszy zakres typów HPV. Dodatkowe różnice w wykrywaniu HPV w CRC były związane z regionalnymi różnicami w częstości występowania infekcji HPV, na które wpływ ma pochodzenie rasowe/etniczne i geograficzne badanej osoby. Na przykład, HPV-18 jest najczęściej wykrywany w przypadkach CRC z Azji i Europy .

HPV został wykryty w tkankach CRC w wielu próbkach guza uzyskanych w całej okrężnicy. HPV wykryto w 21,05% guzów proksymalnych, 42,11% guzów dystalnych i 36,84% guzów w odbytnicy. Szeroki rozkład anatomiczny zakażeń HPV w tkance nowotworowej CRC sugeruje, że zakażenie HPV w CRC nie jest wynikiem wstecznej transmisji wirusa z okolic anogenitalnych. Biorąc pod uwagę te wyniki, nie możemy odrzucić możliwości rozsiewu hematologicznego, jak sugerują Bodaghi i wsp. Istnieją dowody na zakażenia HPV u niemowląt i studentek uniwersytetów, które nigdy nie uprawiały seksu penetracyjnego, co potwierdza, że transmisja HPV innymi drogami niż płciowa może istnieć. Chociaż HPV jest chorobą przenoszoną drogą płciową, nie zbieraliśmy informacji o zachowaniach seksualnych, co pozwoliłoby nam ocenić, czy istnieje jakiekolwiek powiązanie między CRC a zachowaniami seksualnymi.

Integracja wirusa w genomie gospodarza jest krytycznym krokiem w kancerogenezie szyjki macicy. Integracja HPV w genomie gospodarza została odnotowana w około 90% przypadków raka szyjki macicy. Przypadki te wykazują ekspresję onkogenów wirusowych E6 i E7. Status fizyczny HPV może być wykryty przez brak produktu PCR, ponieważ otwarta ramka odczytu E2 jest zaburzona, gdy HPV integruje się z genomem gospodarza. Potencjalne ograniczenia przy użyciu tej metody mogą obejmować następujące kwestie: test może wykryć zintegrowane wirusowe DNA tylko przy braku episomalnego DNA HPV, nie może rozróżnić czystych form episomalnych i mieszanych, a możliwość wirusowej integracji bez utraty fragmentu genu E2 nie jest brana pod uwagę. Jednak w naszym badaniu wszystkie badane przypadki HPV-16 pozytywne wykazywały integrację, co odrzuca obecność genomów episomalnych. Wysoki odsetek integracji genomu HPV-16 z genomem gospodarza wspiera możliwość, że HPV może odgrywać rolę w kancerogenezie jelita grubego. Nasze wyniki, choć zachęcające, muszą być interpretowane ostrożnie. Pomimo wysokiej częstości występowania infekcji w guzach jelita grubego typem HPV wysokiego ryzyka (HPV-16) i dowodami integracji genomu wirusowego, przyszłe badania muszą ocenić, czy infekcje HPV są aktywne i czy onkoproteiny E6 i E7 ulegają ekspresji, aby przyczynić się i/lub mieć przyczynową rolę w kancerogenezie jelita grubego.

Nasze badanie ma stosunkowo niewielką wielkość próby, co może być ograniczeniem dla stratyfikowanych i ograniczonych analiz. Może to skutkować pewnymi niedokładnymi szacunkami (o czym świadczą szerokie 95% przedziały ufności). Niemniej jednak, wielkość obserwowanych ilorazów szans dla związku między HPV a CRC jest bardzo wysoka i mało prawdopodobne jest, aby wynikała z błędu statystycznego typu I. Dane uzyskane w tym badaniu w połączeniu z doniesieniami w piśmiennictwie nie są jeszcze wystarczające do stwierdzenia, że HPV jest czynnikiem sprawczym CRC zgodnie z kryteriami przyczynowości Bradforda Hilla. Spełnionych jest 5 z 9 postulowanych kryteriów. (1) Siła: w tym badaniu i w literaturze odnotowano silne statystycznie istotne związki. (2) Spójność: HPV został wykryty w CRC w innych badaniach z zastosowaniem tej samej metodologii . (3) Wiarygodność: HPV integruje się z genomem gospodarza i wyraża białka onkogenne, o których wiadomo, że promują karcynogenezę . (4) Analogia: wirusy HPV wysokiego ryzyka, takie jak HPV-16, odgrywają rolę przyczynową w innych nowotworach, takich jak rak szyjki macicy. (5) Czasowość: HPV został również wykryty w gruczolakach, zmianach prekursorowych CRC . Dodatkowe badania podłużne oceniające rolę HPV w kancerogenezie jelita grubego są potrzebne, aby w pełni poprzeć kryterium spójności i czasowości. Podsumowując, niniejsze badanie donosi o wysokiej częstości występowania infekcji HPV, wysokiej częstości występowania HPV-16 (typ wysokiego ryzyka) i integracji genomu HPV-16 w tkance guza jelita grubego od Latynosów z Karaibów. Dalsze analizy są uzasadnione w celu ustalenia związku przyczynowego między HPV a CRC.

Konflikt interesów

Autorzy oświadczyli, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Projekt ten był wspierany przez RCMI Grant G12MD007600 i Grant U54MD007587 z NIMHD. Dodatkowego wsparcia udzieliły granty R21CA167220 i U54CA096297 z NCI. Autorzy chcieliby podziękować Dr. Ana Patricia Ortiz za krytyczne przeczytanie tej pracy.