Em geral, três características primárias de compostos químicos podem ser usadas para criar separações por HPLC. São elas:
– Polaridade
– Carga elétrica
– Tamanho molecular
Primeiro, vamos considerar a polaridade e os dois modos de separação primária que exploram esta característica: fase normal e cromatografia de fase reversa.
Separações baseadas na polaridade
A estrutura, atividade e características físico-químicas de uma molécula são determinadas pela disposição de seus átomos constituintes e as ligações entre eles. Dentro de uma molécula, uma disposição específica de certos átomos que é responsável por propriedades especiais e reações químicas previsíveis é chamada grupo funcional. Esta estrutura frequentemente determina se a molécula é polar ou não polar. As moléculas orgânicas são classificadas em classes de acordo com o(s) principal(is) grupo(s) funcional(ais) que cada uma contém. Usando um modo de separação baseado na polaridade, a retenção cromatográfica relativa de diferentes tipos de moléculas é largamente determinada pela natureza e localização destes grupos funcionais. Como mostrado na Figura P, classes de moléculas podem ser ordenadas por sua retenção relativa em uma faixa ou espectro de polaridade cromatográfica de altamente polar a altamente não-polar.
Figure P: Chromatographic Polarity Spectrum by Analyte Functional Group
A água é um composto polar. O benzeno é um composto não polar. Moléculas com polaridade cromatográfica semelhante tendem a ser atraídas umas pelas outras; aquelas com polaridade diferente exibem atração muito mais fraca, se houver, e podem até se repelir umas às outras. Esta torna-se a base para modos de separação cromatográfica baseados na polaridade.
Uma outra forma de pensar é pela analogia familiar: óleo e água não se misturam. Ao contrário do magnetismo onde pólos opostos se atraem uns aos outros, as separações cromatográficas baseadas na polaridade dependem da atração mais forte entre gostos e da atração mais fraca entre opostos. Lembre-se, “Como atrai como” na cromatografia baseada em polaridade
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Figure Q: Combinação adequada de fases móveis e estacionárias Separação de efeitos baseada em polaridade
Para projetar um sistema de separação cromatográfica, criamos competição para os vários compostos contidos na amostra escolhendo uma fase móvel e uma fase estacionária com diferentes polaridades. Então, compostos na amostra que são semelhantes em polaridade à fase estacionária serão atrasados porque são mais fortemente atraídos pelas partículas. Compostos cuja polaridade é semelhante à da fase móvel serão preferencialmente atraídos para ela e se moverão mais rapidamente.
Desta forma, com base nas diferenças na atração relativa de cada composto para cada fase, uma separação é criada alterando as velocidades dos analitos.
Figuras R-1, R-2 e R-3 exibem faixas de polaridade cromatográficas típicas para fases móveis, fases estacionárias e analitos de amostra, respectivamente. Vamos considerar cada um por sua vez para ver como um cromatógrafo escolhe as fases apropriadas para desenvolver a competição de atração necessária para alcançar uma separação por HPLC baseada em polaridade.
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Figure R-1: Mobile Phase Chromatographic Polarity Spectrum
A scale, such as that shown in Figure R-1, upon which some common solvents are placed in order of relative chromatographic polarity is called an eluotropic series. Moléculas de fase móvel que competem efetivamente com as moléculas de analitos para os atrativos locais de fase estacionária deslocam esses analitos, fazendo com que eles se movam mais rapidamente através da coluna . A água está na extremidade polar da escala do solvente de fase móvel, enquanto o hexano, um hidrocarboneto alifático, está na extremidade não polar. No meio, solventes simples, bem como misturas miscível-solvente , podem ser colocados em ordem de força de eluição. Qual extremidade da escala representa a fase móvel mais “forte” depende da natureza da superfície da fase estacionária onde ocorre a competição pelas moléculas da substância a analisar.
Figure R-2: Staary Phase Particle Chromatographic Polarity Spectrum
Sílica tem uma superfície ativa, hidrofílica contendo grupos funcionais de silanol ácido. Consequentemente, ela cai na extremidade polar da escala de fase estacionária mostrada na Figura R-2. A atividade ou polaridade da superfície da sílica pode ser modificada seletivamente através da ligação química a ela de grupos funcionais menos polares . Exemplos mostrados aqui incluem, em ordem decrescente de polaridade, cianopropilsilil- , n-octilsilil- , e n-octadecylsilil- moieties sobre sílica. Esta última é uma embalagem hidrofóbica , muito não-polar.
Figure R-3: Compound/Analyte Chromatographic Polarity Spectrum
Figure R-3 repete o espectro de polaridade cromatográfica da nossa amostra . Após considerar a polaridade de ambas as fases, então, para uma determinada fase estacionária, um cromatógrafo deve escolher uma fase móvel na qual os analitos de interesse são retidos, mas não tão fortemente que não possam ser eluídos. Entre os solventes de força semelhante, o cromatógrafo considera qual combinação de fases pode explorar melhor as diferenças mais sutis na polaridade e solubilidade da substância a analisar para maximizar a seletividade do sistema cromatográfico. Como atrai, mas, como você provavelmente pode imaginar a partir da discussão até agora, criar uma separação baseada na polaridade envolve conhecimento da amostra e experiência com vários tipos de analitos e modos de retenção. Para resumir, o cromatógrafo irá escolher a melhor combinação de fase móvel e fase estacionária de partículas com polaridades adequadamente opostas. Então, à medida que os analitos da amostra se movem através da coluna, a regra como atrai como determina quais analitos diminuem a velocidade e quais procedem a uma velocidade mais rápida.
Normal-Phase HPLC
Em suas separações de extratos de plantas, Tswett teve sucesso usando uma fase polar estacionária com uma fase muito menos polar móvel. Este modo clássico de cromatografia ficou conhecido como fase normal.
Figure S-1: Normal-Phase Chromatography
Figure S-1 representa uma separação cromatográfica de fase normal da nossa mistura de teste de três tinturas. A fase estacionária é polar e retém o corante amarelo polar mais fortemente. O corante azul relativamente não polar é vencido na competição de retenção pela fase móvel, um solvente não polar, e se elui rapidamente. Uma vez que o corante azul é mais parecido com a fase móvel, ele se move mais rapidamente. É típico da cromatografia de fase normal em sílica que a fase móvel é 100% orgânica; não é utilizada água.
HPLC de fase invertida
O termo fase invertida descreve o modo de cromatografia que é exatamente o oposto da fase normal, ou seja, o uso de uma fase polar móvel e uma fase não-polar estacionária. A figura S-2 ilustra a mistura preta de três tinturas sendo separada usando tal protocolo.
Figure S-2: Cromatografia de fase reversa
Agora o composto mais fortemente retido é o corante azul mais não polar, pois sua atração para a fase não polar estacionária é maior. O corante amarelo polar, sendo fracamente retido, é ganho em competição pela fase polar, aquosa móvel, move-se mais rapidamente através do leito, e elui mais cedo como atrações como.
Hoje, porque é mais reprodutível e tem ampla aplicabilidade, a cromatografia de fase reversa é usada para aproximadamente 75% de todos os métodos de HPLC. A maioria destes protocolos usam como fase móvel uma mistura aquosa de água com um miscível, solvente orgânico polar, como o acetonitrilo ou metanol. Isso normalmente garante a interação adequada dos analitos com a superfície da partícula não polar e hidrofóbica. Uma sílica C18 é o tipo mais popular de embalagem de HPLC de fase reversa.
Table C apresenta um resumo das características de fase para os dois principais modos de separação de HPLC com base na polaridade. Lembre-se, para estes modos baseados na polaridade, como atrai como.
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Tabela C: Características de fase para separações baseadas em polaridade
Cromatografia de interacção hidrófila
HILIC pode ser vista como uma variante da cromatografia de fase normal. Na cromatografia de fase normal, a fase móvel é 100% orgânica. Apenas vestígios de água estão presentes na fase móvel e nos poros das partículas da embalagem polar. Os analitos polares ligam-se fortemente à fase polar estacionária e podem não eluir.
Adicionar um pouco de água à fase móvel orgânica torna possível separar e eluir compostos polares que são fortemente retidos no modo de fase normal. A água, um solvente muito polar, compete efetivamente com os analitos polares para a fase estacionária. HILIC pode ser executado nos modos de eluição isocrática ou gradiente. Os compostos polares que são inicialmente atraídos pelas partículas do material de embalagem polar podem ser eluídos à medida que a polaridade da fase móvel é aumentada . Os analitos são eluídos em ordem crescente de hidrofilicidade . Os tampões ou sais podem ser adicionados à fase móvel para manter os analitos ionizáveis em uma única forma.
Cromatografia de Interação Hidrofóbica
HIC é um tipo de cromatografia de fase reversa que é usada para separar biomoléculas grandes, tais como proteínas. É normalmente desejável manter estas moléculas intactas numa solução aquosa, evitando o contacto com solventes orgânicos ou superfícies que as possam desnaturar. A HIC aproveita a interação hidrofóbica de moléculas grandes com uma fase estacionária moderadamente hidrofóbica, por exemplo, butílica, em vez de octadecílica, sílica. Inicialmente, concentrações mais altas de sal na água irão encorajar as proteínas a serem retidas na embalagem. As separações gradientes são tipicamente feitas diminuindo a concentração de sal. Desta forma, biomoléculas são eluídas em ordem de aumentar a hidrofobicidade.
Separações baseadas em Carga: Cromatografia de troca iónica
Para separações baseadas na polaridade, como é atraída por similares e os opostos podem ser repelidos. Na cromatografia de troca iônica e outras separações baseadas em carga elétrica, a regra é invertida. Os gostos podem repelir, enquanto os opostos são atraídos uns pelos outros. As fases estacionárias das separações por troca de íons são caracterizadas pela natureza e força das funções ácidas ou básicas em suas superfícies e os tipos de íons que elas atraem e retêm. A troca catiónica é utilizada para reter e separar iões com carga positiva sobre uma superfície negativa. Por outro lado, a troca aniônica é usada para reter e separar íons com carga negativa em uma superfície positiva. Com cada tipo de troca de íons, há pelo menos duas abordagens gerais para separação e eluição.
Figure T: Cromatografia de troca iônica
Transmissores de íons fortes suportam grupos funcionais que são sempre ionizados. Eles são tipicamente usados para reter e separar íons fracos. Estes íons fracos podem ser eluídos por deslocamento com uma fase móvel contendo íons que são mais fortemente atraídos para os locais de fase estacionária. Alternativamente, os iões fracos podem ser retidos na coluna, depois neutralizados por alteração in situ do pH da fase móvel, fazendo com que percam a sua atracção e eluam.
Os permutadores de iões fracos podem ser neutralizados acima ou abaixo de um determinado valor de pH e perder a sua capacidade de reter os iões por carga. Quando carregados, eles são utilizados para reter e separar íons fortes. Se esses íons não puderem ser eluídos por deslocamento, então os locais de troca de fase estacionária podem ser neutralizados, desligando a atração iônica e permitindo a eluição dos analitos carregados.
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Tabela D: Diretrizes de troca iônica
Quando os trocadores de íons fracos são neutralizados, eles podem reter e separar espécies por interações hidrofóbicas ou hidrofílicas; nesses casos, a força de eluição é determinada pela polaridade da fase móvel. Assim, trocadores de íons fracos podem ser usados para separações de modo misto .
Table D esboça diretrizes para as principais categorias de troca de íons. Por exemplo, para reter um analito fortemente básico , use uma partícula de fase estacionária de troca fraca a pH >7; isto assegura uma superfície de partícula com carga negativa. Para liberar ou eluir a base forte, baixe o pH da fase móvel abaixo de 3; isto remove a carga superficial e desliga o mecanismo de retenção da troca iônica.
Note que um pKa é o valor de pH no qual 50% do grupo funcional é ionizado e 50% é neutro. Para assegurar uma superfície de análise ou partícula essencialmente neutra, ou totalmente carregada, o pH deve ser ajustado para um valor pelo menos 2 unidades além do pKa, conforme apropriado .
Não utilize um permutador de estrangulamento para reter uma base forte; ambos permanecem carregados e fortemente atraídos um pelo outro, tornando a base quase impossível de eluir. Ele só pode ser removido através de um permutador de catiões fortes com uma base concorrente que exibe uma retenção ainda mais forte e desloca o composto de interesse ao vencer a competição para os locais de troca ativa. Esta abordagem é raramente prática, ou segura, em HPLC e SPE.
Separações com base no tamanho: Cromatografia de Exclusão de Tamanho –
Nos anos 50, Porath e Flodin descobriram que as biomoléculas podiam ser separadas com base no seu tamanho, e não na sua carga ou polaridade, passando-as, ou filtrando-as, através de um polímero de dextrano hidrofílico de porosidade controlada. Este processo foi denominado de filtração em gel. Mais tarde, um esquema análogo foi usado para separar oligómeros sintéticos e polímeros usando embalagens de polímeros orgânicos com faixas específicas de tamanho de poros. Este processo foi chamado de cromatografia de permeação em gel. Separações similares feitas usando embalagens de sílica de porosidade controlada foram chamadas de cromatografia de exclusão de tamanho . Introduzidos em 1963, os primeiros instrumentos comerciais de HPLC foram projetados para aplicações GPC .
Todas essas técnicas são tipicamente feitas em fases estacionárias que foram sintetizadas com uma distribuição porosa em uma faixa que permite que os analitos de interesse entrem, ou sejam excluídos, mais ou menos do volume do poro da embalagem. Moléculas menores penetram mais nos poros na sua passagem através do leito. Moléculas maiores só podem penetrar poros acima de um certo tamanho para que passem menos tempo no leito. As moléculas maiores podem ser totalmente excluídas dos poros e passar apenas entre as partículas, eluindo muito rapidamente em um pequeno volume. As fases móveis são escolhidas por duas razões: primeiro, são bons solventes para os analitos; e, segundo, podem impedir qualquer interação entre os analitos e a superfície da fase estacionária. Desta forma, as moléculas maiores eluem primeiro, enquanto as moléculas menores viajam mais devagar e eluem depois, em ordem decrescente do seu tamanho em solução. Daí a regra simples: as grandes saem primeiro.
Desde que é possível correlacionar o peso molecular de um polímero com o seu tamanho em solução, o GPC revolucionou a medição da distribuição de peso molecular dos polímeros que, por sua vez, determina as características físicas que podem melhorar ou diminuir o processamento, qualidade e desempenho do polímero .