Para estudar o efeito do aumento da concentração enzimática sobre a taxa de reacção, o substrato deve estar presente em quantidade excessiva; isto é, a reacção deve ser independente da concentração do substrato. Qualquer alteração na quantidade de produto formado durante um período de tempo especificado dependerá do nível de enzima presente. Graficamente isto pode ser representado como:
Estas reacções são ditas “ordem zero” porque as taxas são independentes da concentração do substrato, e são iguais a alguma constante k. A formação do produto procede a uma taxa que é linear com o tempo. A adição de mais substrato não serve para aumentar a taxa. Na cinética de ordem zero, permitindo que o ensaio seja executado por tempo duplo resulta no dobro da quantidade de produto.
| Ordem | Equação da taxa | |
|---|---|---|
| zero | taxa = k | a taxa é independente da concentração do substrato |
| primeiro | a taxa = k | a taxa é proporcional à primeira potência de concentração do substrato |
| segundo | rate = k=k2 | rate é proporcional ao quadrado da concentração do substrato |
| segundo | rate = k | a taxa é proporcional à primeira potência de cada um de dois reagentes |
A quantidade de enzima presente numa reacção é medida pela actividade que ela catalisa. A relação entre actividade e concentração é afectada por muitos factores, tais como temperatura, pH, etc. Um ensaio enzimático deve ser concebido para que a actividade observada seja proporcional à quantidade de enzima presente para que a concentração da enzima seja o único factor limitante. Ele só é satisfeito quando a reação é de ordem zero.
Na Figura 5, a atividade é diretamente proporcional à concentração na área AB, mas não em BC. A atividade enzimática é geralmente maior quando a concentração do substrato não é limitada.
Quando a concentração do produto de uma reação enzimática é plotada contra o tempo, uma curva semelhante resulta, Figura 6.
Entre A e B, a curva representa uma reação de ordem zero, ou seja, uma em que a taxa é constante com o tempo. Como o substrato é utilizado, os locais ativos da enzima não estão mais saturados, a concentração do substrato torna-se limitadora da taxa, e a reação torna-se a primeira ordem entre B e C.
Para medir a atividade enzimática idealmente, as medidas devem ser feitas naquela porção da curva onde a reação é de ordem zero. É mais provável que uma reacção seja inicialmente de ordem zero, uma vez que a concentração do substrato é então mais elevada. Para ter certeza de que uma reação é de ordem zero, múltiplas medições da concentração do produto (ou substrato) devem ser feitas.
Figure 7 ilustra três tipos de reações que podem ser encontradas em ensaios enzimáticos e mostra os problemas que podem ser contados se apenas medições únicas forem feitas.
B é uma linha reta representando uma reação de ordem zero que permite a determinação precisa da atividade enzimática durante parte ou todo o tempo da reação. A representa o tipo de reação que foi mostrado na Figura 6. Esta reação é inicialmente de ordem zero e depois retarda, presumivelmente devido à exaustão do substrato ou inibição do produto. Este tipo de reacção é por vezes referido como uma reacção “principal”. A verdadeira atividade “potencial” é representada pela linha pontilhada. A curva C representa uma reacção com uma fase inicial de “atraso”. Novamente a linha pontilhada representa a atividade potencialmente mensurável. Múltiplas determinações de concentração de produto permitem que cada curva seja plotada e a verdadeira atividade determinada. Uma única determinação do ponto final em E levaria à falsa conclusão de que as três amostras tinham concentração enzimática idêntica.