Alta Prevalência de Papilomavírus Humano em Câncer Colorretal em Hispânicos: A Case-Control Study

Abstract

O papel do Papilomavírus Humano (HPV) na carcinogênese colorretal permanece elusivo. Baseado na alta incidência de malignidades associadas ao HPV entre hispânicos porto-riquenhos, este estudo teve como objetivo avaliar a prevalência da infecção pelo HPV e a integração viral nos tecidos colorretais a fim de avaliar seu papel putativo no câncer colorretal (CRC). Neste estudo caso-controle, a prevalência da infecção por HPV no CRC (casos n = 45) e na mucosa do cólon normal de indivíduos livres de câncer (controles n = 36) foi avaliada por uma estratégia de PCR aninhada. A genotipagem do HPV-16 foi realizada em tecidos positivos ao HPV e o estado físico do genoma HPV-16 foi determinado pela detecção do E2. O HPV foi detectado em 19 de 45 (42,2%) casos de CRC (média de idade 61,1 ± 10,7 anos, 24 homens) e em 1 de 36 (2,8%) controles (média de idade 60,9 ± 9,6 anos, 24 homens) com OR = 25,58 (95% CI 3,21 a 203,49). O HPV-16 foi detectado em 63,2% dos tumores colorretais positivos ao HPV; a integração do genoma foi observada em todos os casos positivos ao HPV-16. Este é o primeiro relato mostrando a alta prevalência de infecções por HPV em tumores colorretais hispânicos do Caribe. Apesar da evidência da integração do HPV no genoma hospedeiro, justifica-se uma análise mecanicista mais aprofundada examinando a expressão da oncoproteína HPV e o papel putativo destas oncoproteínas na carcinogênese colorretal.

1. Introdução

Infecções pelo Papilomavírus Humano (HPV) são as infecções sexualmente transmissíveis mais comuns nos Estados Unidos (US) (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). Os HPVs são vírus de DNA epiteliotrópicos de dupla cadeia que infectam os epitélios escamosos das células mucosas da pele. A multiplicação viral ocorre nos núcleos celulares e está intimamente ligada ao estado de diferenciação da célula. Existem bem mais de 100 genótipos de HPV. Os tipos 6, 11, 40 e 42 estão normalmente associados a lesões benignas e são classificados como tipos de baixo risco. HPV-16, HPV-18, HPV-31 e HPV-45 são considerados de alto potencial oncogênico e são referidos como tipos de alto risco. O HPV foi identificado como um agente causal nos cancros cervical, vaginal, anal, oral e peniano. Estudos também mostraram fortes correlações entre o HPV e o desenvolvimento de muitos tipos de cânceres como o esôfago, faringe e laringe. Entretanto, o papel putativo da infecção pelo HPV na carcinogênese colorretal não foi devidamente elucidado e ainda permanece controverso.

A patogênese do CRC tornou-se melhor compreendida a nível molecular; entretanto, a etiologia do CRC ainda é incompletamente compreendida. Na última década, vários estudos sugeriram que o HPV pode ter um papel na carcinogênese colorretal. A detecção do HPV no tecido colônico tem levado a uma ampla gama de trabalhos propondo uma associação causal entre HPV e CRC. A presença do HPV no tecido do cólon continua a ser um tema de discussão altamente controverso devido a inconsistências na reprodutibilidade dos resultados. Uma vez que a integração do genoma HPV é necessária para que o vírus exerça o seu potencial cancerígeno, a avaliação do estado físico do genoma viral após a confirmação da infecção pelo HPV é essencial para estabelecer uma associação causal. A inativação do gene E2 através da integração genômica promove a expressão das oncoproteínas E6 e E7, que antagonizam a função da p53 e pRB, respectivamente . A degradação resultante da p53 e pRB mediada por essas oncoproteínas facilita a proliferação do DNA viral dentro do hospedeiro e leva à neoplasia por mecanismos bem descritos em toda a literatura .

CRC é responsável por aproximadamente 694.000 mortes em todo o mundo . Nos EUA, o CRC é o 3º câncer mais comumente diagnosticado e a 3ª causa principal de morte por câncer . Em Porto Rico (PR), a CRC é a 2ª mais diagnosticada e a principal causa de morte por câncer entre homens e mulheres . Uma alta prevalência de cânceres relacionados ao HPV e uma alta prevalência de HPV em amostras anogenitais tem sido relatada entre homens e mulheres porto-riquenhos . A soroprevalência do HPV-16 foi relatada como sendo de 11,3% numa amostra populacional de adultos em RP , o que é semelhante ao relatado nos EUA (11,5%) . Assim, dadas as altas taxas de mortalidade por CRC e a alta incidência de morbidades relacionadas ao HPV em RP, o objetivo geral deste estudo caso-controle foi avaliar a associação entre a infecção por CRC e HPV em amostras de hispânicos porto-riquenhos.

2. Métodos

2,1. Declaração Ética

Este estudo foi aprovado pela Universidade de Ciências Médicas de Porto Rico Campus IRB (#A7330109). Todos os procedimentos foram de acordo com os padrões éticos do IRB.

2.2. Recrutamento de sujeitos e aquisição de amostras

Casos e controles foram recrutados consecutivamente usando amostragem de conveniência e foram ajustados por freqüência por sexo e idade. Os participantes do estudo com 21 anos de idade ou mais foram recrutados quando visitaram as instalações do Centro Médico de Porto Rico para colonoscopias devido à triagem de rotina, sintomas e/ou encaminhamentos por gastroenterologistas e cirurgiões colorretais. O objetivo deste estudo foi explicado e todos os participantes do estudo deram consentimento informado antes da inclusão. Todos os participantes incluídos nesta análise eram hispânicos. Ser hispânico foi definido pela herança ou local de nascimento do participante. Todos os sujeitos de controle incluídos neste estudo tiveram resultados normais em sua colonoscopia. Os indivíduos com CRC tiveram um diagnóstico de adenocarcinoma confirmado pela histopatologia. Foram excluídos os indivíduos com síndromes de câncer hereditário e doença inflamatória intestinal.

E tecido fresco congelado foi obtido de 45 pacientes com CRC não-familiares, esporádicos (casos) e 36 indivíduos livres de câncer (controles). Os tecidos foram colhidos de pacientes com CRC durante a cirurgia de ressecção tumoral. Foram excluídos tumores anais ou perianais e amostras de tecido de indivíduos que relataram ser HIV-positivos. A localização tumoral foi classificada como proximal (do ceco ao cólon transversal distal), distal (da flexão esplênica ao cólon sigmóide), ou reto (últimos 20 cm do cólon). Biópsias de controle do tecido colorretal foram obtidas do cólon distal durante as colonoscopias de rotina.

Usando o Questionário do Fator de Risco de Câncer Colorretal dos Registros Familiares Colaborativos (http://coloncfr.org/), foram coletados dados clínicos e sociodemográficos de cada paciente, incluindo sexo, estilo de vida, história médica e história familiar de câncer. As características sociodemográficas e clínicas analisadas no estudo foram gênero (masculino versus feminino), mediana da idade (<61 anos versus ≥61 anos), diagnóstico de DM tipo 2 (sim versus não), história familiar de qualquer câncer (sim versus não) e história familiar de CRC (sim versus não). A história familiar é definida como tendo um parente de primeiro, segundo ou terceiro grau com câncer. As características de estilo de vida que foram analisadas neste estudo foram o consumo de álcool (ever versus nunca) e o estado de tabagismo (ever versus nunca).

2,3. A extração de DNA

DNA genômico (gDNA) foi extraído de ≈100 mg de tecido usando o DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) seguindo as instruções do fabricante. Para efeitos de controlo de qualidade, -a amplificação do gene de actina PCR foi usada para avaliar a integridade do gDNA; amostras das quais -actin não puderam ser amplificadas foram excluídas do estudo.

As seguintes precauções padronizadas foram tomadas para minimizar a contaminação cruzada amostra a amostra: todos os instrumentos e bancadas de trabalho foram limpas com DNAZap (Ambion, Foster City, CA), seguidas de 10% de lixívia e 70% de ETOH antes da manipulação da amostra. Para cada amostra foram utilizadas lâminas novas e esterilizadas. O processamento de tecidos e a extração de nucleotídeos foram limitados a um máximo de 10 amostras por dia. Aproximadamente 100 mg de cada amostra foram codificados aleatoriamente de forma cega e utilizados para análises posteriores.

2,4. Detecção e Genotipagem de HPV

A detecção do ADN HPV humano foi realizada através de uma estratégia de PCR aninhada usando PGMY09/PGMY11 como primários externos e GP5+/GP6+ como primários internos . Estes primers amplificam uma região de consenso HPV L1 que detecta mais de 25 tipos de HPV. Cada reação foi realizada num volume total de 25 μL contendo 200 ng de gDNA, 12,5 μL de Bullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO), e 100 nmol/L de primers PGMY09/11 agrupados. Foram utilizadas as seguintes condições: 15 minutos a 95°C, seguidos de 35 ciclos de 60 segundos cada um a 94°C, 60°C e 72°C, com uma extensão final de 10 minutos a 72°C. Foram usados dois microlitros da primeira reacção PCR como modelo para a PCR aninhada. As condições para a PCR aninhada foram idênticas às da PCR de primeira execução com excepção da temperatura de recozimento que foi de 52°C. Os produtos amplificados foram electroforados e analisados usando um ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA). A detecção do DNA plasmídeo purificado de pHPV-16 (ATCC 45113D) foi usada como controle positivo e a água como controle negativo.

HPV-16 A genotipagem do DNA foi realizada com os primers específicos do tipo visando o HPV-16 E6 . Os primários HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAGAAC-3′) e Pr625 (5′-GATCAGTTGTGTCTCTGGGTTGC-3′) foram utilizados para a primeira execução, com as mesmas condições de PCR descritas acima, com excepção da temperatura de recozimento que foi de 68°C. As condições para a PCR aninhada com os iniciadores Pr106: 5′-GTTTCAGGACCCACAGGAGC-3′ e Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGGGTTT C-3′ foram as mesmas, com excepção da temperatura de recozimento que foi de 60°C. A detecção do DNA plasmídeo purificado de pHPV-16 (ATCC 45113D) e da água foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. Os amplificadores foram eletroforescidos e visualizados como descrito. Dez por cento das amostras testadas por PCR aninhadas foram validadas externamente e confirmadas no Laboratório do Programa de Pesquisa em AIDS da Faculdade de Medicina de Ponce & Ciências da Saúde (Ponce, PR) usando o kit INNO-LiPA HPV Genotyping Extra Kit (Fujirebio, Gent, Bélgica).

2,5. HPV Physical Status

O status físico do genoma HPV-16 foi determinado pelo exame da integridade da sequência E2 usando uma estratégia de PCR previamente descrita. Todos os tumores que abrigam o DNA do HPV-16 foram analisados (). A análise PCR aninhada foi realizada utilizando 2 conjuntos de iniciadores HPV-16 específicos que incluíam 2 iniciadores frontais, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) e Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′), e 2 cartilhas invertidas, Pr128 (5′-GTCGCTCCTGTGGGTCCTG-3′) e Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAGTGTGC-3′). Ambas as PCRs foram realizadas sob as mesmas condições descritas anteriormente, com excepção da temperatura de recozimento que foi de 60°C. Os amplplons foram analisados conforme descrito. O ADN extraído das linhas de células cervicais humanas CaSki (CRL-1550) e SiHa (HTB-35) foi utilizado como controlo positivo. A ausência do produto PCR foi interpretada como perturbação da sequência E2 e integração do ADN viral no genoma do hospedeiro. A presença de amplicons E2 indica a presença de genomas episomais HPV-16.

2.6. Análise estatística

Características sociodemográficas, clínicas e de estilo de vida nos casos e controles foram descritas usando distribuições de freqüência para variáveis categóricas e medidas sumárias para variáveis quantitativas. Testes em dois lados foram usados para comparar grupos de estudo: o teste qui-quadrado ou o teste exato de Fisher foi usado para variáveis categóricas e o teste de Student ou Mann-Whitney para comparar variáveis quantitativas. Modelos de regressão logística incondicional foram usados para estimar o OR com 95% de confiança do CRC em relação ao estado do HPV e outras variáveis. Análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 17.0 (SPSS Inc.) e Epi InfoTM 7 (CDC).

3. Resultados

3.1. Características sociodemográficas, estilo de vida e história clínica dos participantes do estudo

As características demográficas e clínicas da população estudada (; 45 casos CRC e 36 controles) são apresentadas na Tabela 1. A idade média dos casos de CRC foi de 61,1 anos (variando de 38 a 86 anos; 24 eram do sexo masculino). No grupo controle, a idade média foi de 60,9 anos (variando de 42 a 85 anos; 15 eram do sexo masculino). Em comparação com os controles, os casos de CRC tinham maior probabilidade de relatar um histórico familiar de CRC (OR 0,29; 95% 0,10-0,80). Em termos de idade dos membros da família com CRC, como dado pelo sujeito, a mediana da idade do diagnóstico de CRC nos familiares dos casos e controles foi de 60 anos. Não foram encontradas associações estatisticamente significativas na comparação de casos e controles com familiares diagnosticados com CRC em ≥60 anos versus <60 anos. Não foram encontradas outras associações significativas.

3.2. Detecção do DNA do HPV

Uma diferença significativa na prevalência da infecção pelo HPV foi observada quando se compararam tecidos tumorais colorretais e mucosa normal dos controles. O DNA do HPV foi detectado em 19 das 45 (42,2%) amostras de CRC e em 1 das 36 (2,8%) amostras de controle estudadas (Figura 1). A infecção pelo HPV foi associada positivamente ao CRC (OR 25,58; IC 95% 3,22 a 203,49), (Tabela 2). A associação entre o estado HPV-positivo e o CRC foi observada em todas as regiões anatômicas do cólon.

3.3. Características sociodemográficas, estilo de vida e clinico-patológicas dos casos HPV-positivos

A idade média do CRC HPV-positivo foi de 60,3 anos (variando de 45 a 86; 9 eram do sexo masculino). Não foram encontradas associações significativas entre o estado HPV-positivo e os seguintes: sexo, idade, uso de tabaco ou álcool, histórico de diabetes, histórico familiar de qualquer câncer ou histórico familiar de CRC (Tabela 3). Não foram observadas associações significativas entre o estado HPV e a diferenciação histológica, estágio do tumor ou localização (Tabela 4).

3.4. HPV-16 Genotipagem e avaliação do estado físico viral

HPV-16 foi detectado em 12 das 19 amostras de CRC positivas para HPV (63,2%); os 7 (36,8%) restantes corresponderam a outros genótipos de HPV (não digitados). O HPV-16 não foi detectado na amostra de controle do HPV-positivo. As distribuições dos tumores HPV-16 positivos em relação à localização do tumor foram as seguintes: 33,3% (4 de 12) das amostras foram encontradas no cólon proximal (ceco, cólon ascendente e cólon transversal), 50,0% (6 de 12) foram encontradas no cólon distal (flexão esplênica, cólon descendente e cólon sigmóide) e 16,7% (2 de 12) foram detectados no reto. Para tumores não-HPV-16, 2 de 7 (28,6%) foram localizados no cólon distal e 5 de 7 (71,43%) foram encontrados no reto. O estado físico do ADN do HPV-16 nos tecidos CRC foi determinado pela detecção do HPV-16 E2. O amplicon correspondente ao E2 intacto não foi detectado em nenhum dos casos positivos do HPV-16 indicando que o genoma HPV-16 foi integrado.

4. Discussão e Conclusões

HPV foi detectado em tumores colorretais . Entretanto, o papel do HPV na carcinogênese colorretal não foi elucidado e o assunto permanece controverso. Na presente investigação, relatamos uma avaliação rigorosa das infecções por HPV nos tecidos colorretais (casos de CRC e controles normais da mucosa) de uma população hispânica bem caracterizada, relatando uma alta incidência de malignidades associadas ao HPV e uma alta taxa de mortalidade por CRC . A genotipagem do HPV-16 e o estado físico do genoma HPV-16 também foram avaliados.

Uma alta prevalência de infecção pelo HPV (42,2%) foi detectada nos tecidos tumorais analisados. Apenas 1 das 36 (2,8%) amostras de controle foi positiva para um tipo não-HPV-16. A prevalência de infecções por HPV em tumores colorretais encontrada em nossa coorte é comparável a porcentagens previamente relatadas em estudos de diferentes países utilizando diferentes abordagens experimentais . A análise imunoistoquímica de amostras de tecido com parafina fixada em formalina (FFPE) de indivíduos nos EUA (; 30 controles, 30 adenomas e 43 CRC) detectaram DNA do HPV em 27% e 69% dos adenomas e CRC, respectivamente . Análises de PCR tipo HPV de DNA de amostras de FFPE de indivíduos chineses detectaram HPV em 29% dos adenomas () e em 53% do CRC ( . Usando a mesma estratégia de PCR aninhada usada neste estudo em combinação com PCR in situ, outro estudo detectou DNA de HPV em 51% das amostras de CRC () e não em amostras de controle () de indivíduos nos EUA . Outros estudos que utilizam a mesma estratégia de PCR aninhada com amostras CRC de indivíduos argentinos detectaram HPV em 44% das amostras CRC () . Entretanto, Pérez et al. (2005) relataram que o HPV estava presente em 33% dos tecidos colorretais nãoneoplásicos estudados ( . Em contraste, vários estudos falharam em detectar o HPV e sugeriram que a infecção por HPV não é um fator de risco para o CRC .

HPV-16 é o tipo de alto risco mais comum nas Américas . O HPV-16 também tem sido relatado como altamente prevalente em neoplasias malignas associadas ao HPV em relações públicas, tais como câncer de cabeça e pescoço e cervical. No nosso estudo, o HPV-16 foi o tipo de HPV de alto risco mais prevalente detectado; o HPV-16 esteve presente em 63,2% das amostras de CRC positivas para o HPV (12 de 19), o que é comparável a alguns relatórios anteriores onde o HPV-16 foi o tipo de HPV de alto risco mais prevalente detectado. Da mesma forma, a análise das amostras de CRC positivas para o HPV-16 usando um método de genotipagem baseado em PCR constatou que era o tipo viral mais frequentemente detectado, estando presente em 41 dos 60 casos (68,3%) . A genotipagem do HPV-16 utilizando os mesmos pares de primers utilizados neste estudo detectou o HPV-16 em 36% das amostras de CRC () . Utilizando técnicas de genotipagem do HPV-16 não baseadas em PCR, o HPV-16 foi encontrado em 16-94% das amostras CRC positivas para HPV.

As discrepâncias na literatura que relatam a detecção de HPV e HPV-16 em tumores colorretais podem ser atribuídas a diferenças metodológicas, incluindo desenho do estudo, tipo de amostra de tecido, tamanho da amostra, coleta da amostra e diferenças na sensibilidade da técnica de detecção ou genotipagem do HPV utilizada. Foram utilizadas amostras de tecido congelado porque o ADN extraído é de qualidade superior ao ADN do FFPE, que se encontra degradado. O procedimento de fixação degrada o DNA a fragmentos <200 bp, o que resulta na diminuição do rendimento da PCR e na incapacidade de amplificar alvos longos . Portanto, o DNA extraído do FFPE não é ideal para a estratégia de PCR aninhada utilizada em nossas análises. A combinação do conjunto de primers PGMY/GP+ amplifica o HPV L1 (450 bp). Esta combinação de primers foi considerada mais sensível ao tipo do que os conjuntos de primers MY/GP+, detectando uma gama mais ampla de tipos de HPV . Diferenças adicionais na detecção do HPV no CRC têm sido associadas a variações regionais na prevalência da infecção pelo HPV, que são influenciadas pela origem racial/étnica e geográfica do indivíduo. Por exemplo, o HPV-18 é mais frequentemente detectado em casos de CRC da Ásia e Europa .

HPV foi detectado em tecidos de CRC em múltiplas amostras tumorais obtidas em todo o cólon. O HPV foi detectado em 21,05% dos tumores proximais, 42,11% dos tumores distais, e 36,84% dos tumores no reto. A ampla distribuição anatômica das infecções por HPV no tecido tumoral do CRC implica que a infecção por HPV no CRC não é resultado de uma transmissão viral retrógrada a partir da área anogenital. Dados estes resultados, não podemos descartar a possibilidade de propagação hematológica, como sugerido por Bodaghi et al. . Há evidências de infecções por HPV em bebês e estudantes universitárias que nunca tiveram sexo penetrativo, apoiando que a transmissão do HPV por outras vias não sexuais pode existir. Embora o HPV seja uma doença sexualmente transmissível, não recolhemos informações sobre comportamento sexual, o que nos teria permitido avaliar se existe alguma associação entre CRC e comportamento sexual.

A integração do vírus no genoma do hospedeiro é um passo crítico na carcinogénese cervical. A integração do HPV no genoma hospedeiro tem sido relatada em aproximadamente 90% dos carcinomas cervicais. Estes casos mostram a expressão dos oncogenes virais E6 e E7. O estado físico do HPV pode ser detectado pela ausência de um produto PCR, uma vez que o quadro de leitura aberta do E2 é interrompido quando o HPV se integra no genoma do hospedeiro . As potenciais limitações usando este método podem incluir o seguinte: o ensaio só pode detectar ADN viral integrado na ausência de ADN HPV episomal, não pode discriminar entre formas episomal pura e mista, e a possibilidade de integração viral sem perder o fragmento de gene E2 não é considerada . No entanto, em nosso estudo, todos os casos positivos de HPV-16 testados mostraram integração, o que descarta a presença de genomas episomais. A elevada percentagem de integração do genoma HPV-16 no genoma hospedeiro suporta a possibilidade do HPV ter um papel na carcinogénese colorrectal. Os nossos resultados, embora encorajadores, precisam de ser interpretados com cautela. Apesar da alta prevalência de infecção em tumores colorretais com um tipo de HPV de alto risco (HPV-16) e evidência de integração do genoma viral, estudos futuros precisam avaliar se as infecções por HPV estão ativas e se as oncoproteínas E6 e E7 estão sendo expressas de modo a contribuir e/ou ter um papel causal na carcinogênese colorretal.

Nosso estudo tem um tamanho de amostra relativamente pequeno, o que pode ser uma limitação para análises estratificadas e restritas. Estas podem resultar em algumas estimativas imprecisas (como evidenciado pelos amplos intervalos de confiança de 95%). No entanto, a magnitude dos odds ratios observados para a associação entre HPV e CRC é muito alta e improvável que resulte de um erro estatístico do tipo I. Os dados gerados neste estudo em combinação com relatórios da literatura ainda não são suficientes para concluir que o HPV é um agente causador do CRC de acordo com os Critérios de Causa de Bradford Hill. Cinco dos 9 critérios postulados são cumpridos. (1) Força: fortes associações estatisticamente significativas foram relatadas neste estudo e na literatura . (2) Consistência: O HPV foi detectado no CRC em outros estudos utilizando a mesma metodologia . (3) Plausibilidade: o HPV se integra ao genoma hospedeiro e expressa proteínas oncogênicas conhecidas por promover a carcinogênese . (4) Analogia: os HPVs de alto risco, como o HPV-16, têm um papel causal em outros cânceres, como o câncer cervical . (5) Temporalidade: o HPV também foi detectado em adenomas, lesões precursoras de CRC . Estudos longitudinais adicionais avaliando o papel do HPV durante a carcinogênese colorretal são necessários para suportar totalmente o critério de consistência e temporalidade. Em conclusão, este estudo relata uma alta prevalência da infecção pelo HPV, uma alta prevalência do HPV-16 (um tipo de alto risco) e a integração do genoma HPV-16 no tecido tumoral colorretal dos hispânicos do Caribe. Mais análises são necessárias para estabelecer uma associação causal entre HPV e CRC.

Conflito de Interesses

Os autores declararam que não há conflito de interesses.

Conhecimento

Este projeto foi apoiado pelo RCMI Grant G12MD007600 e Grant U54MD007587 do NIMHD. Apoio adicional foi fornecido pelos Subsídios R21CA167220 e U54CA096297 do NCI. Os autores gostariam de agradecer à Dra. Ana Patricia Ortiz pela leitura crítica deste artigo.