Aby zbadać wpływ zwiększenia stężenia enzymu na szybkość reakcji, substrat musi być obecny w nadmiarze; tzn. reakcja musi być niezależna od stężenia substratu. Każda zmiana w ilości produktu powstałego w określonym czasie będzie zależała od poziomu obecnego enzymu. Graficznie można to przedstawić następująco:
Reakcje te uważa się za „zerowego rzędu”, ponieważ ich szybkość jest niezależna od stężenia substratu i jest równa pewnej stałej k. Tworzenie produktu przebiega z szybkością liniową w czasie. Dodanie większej ilości substratu nie służy zwiększeniu szybkości. W kinetyce zerowego rzędu, pozwalając, aby badanie przebiegało przez podwójny czas powoduje podwojenie ilości produktu.
| Order | Rate Equation | |
|---|---|---|
| zero | rate =. k | prędkość jest niezależna od stężenia substratu |
| pierwsza | prędkość = k | prędkość jest proporcjonalna do pierwszej potęgi stężenia substratu |
| drugie | stopień = k=k2 | stopień jest proporcjonalny do kwadratu stężenia substratu |
| drugie | stopień = k | prędkość jest proporcjonalna do pierwszej potęgi każdego z dwóch reagentów |
Miarą ilości enzymu obecnego w reakcji jest aktywność, którą katalizuje. Na zależność między aktywnością a stężeniem ma wpływ wiele czynników, takich jak temperatura, pH itp. Próba enzymatyczna musi być zaprojektowana tak, aby obserwowana aktywność była proporcjonalna do ilości obecnego enzymu, aby stężenie enzymu było jedynym czynnikiem ograniczającym. Jest to spełnione tylko wtedy, gdy reakcja jest zerowego rzędu.
Na rysunku 5, aktywność jest wprost proporcjonalna do stężenia w obszarze AB, ale nie w BC. Aktywność enzymu jest na ogół największa, gdy stężenie substratu jest nieograniczone.
Gdy stężenie produktu reakcji enzymatycznej jest wykreślane w funkcji czasu, otrzymujemy podobną krzywą, Rysunek 6.
Pomiędzy A i B, krzywa przedstawia reakcję zerowego rzędu; to znaczy taką, w której szybkość jest stała w czasie. W miarę zużywania substratu, miejsca aktywne enzymu nie są już nasycone, stężenie substratu staje się ograniczeniem szybkości, a reakcja staje się reakcją pierwszego rzędu pomiędzy B i C.
Aby idealnie zmierzyć aktywność enzymu, pomiary muszą być wykonane w tej części krzywej, w której reakcja jest zerowego rzędu. Jest najbardziej prawdopodobne, że początkowo reakcja jest zerowego rzędu, ponieważ stężenie substratu jest wtedy najwyższe. Aby mieć pewność, że reakcja jest zerowego rzędu, należy dokonać wielokrotnych pomiarów stężenia produktu (lub substratu).
Rysunek 7 ilustruje trzy typy reakcji, które można napotkać w analizach enzymatycznych i pokazuje problemy, jakie można napotkać, jeżeli dokonywane są tylko pojedyncze pomiary.
B jest linią prostą reprezentującą reakcję zerowego rzędu, która pozwala na dokładne określenie aktywności enzymu przez część lub cały czas trwania reakcji. A przedstawia typ reakcji, który został przedstawiony na rysunku 6. Reakcja ta jest początkowo zerowego rzędu, a następnie ulega spowolnieniu, przypuszczalnie z powodu wyczerpania substratu lub zahamowania produktu. Ten typ reakcji jest czasami określany jako reakcja „wiodąca”. Prawdziwa aktywność „potencjalna” jest reprezentowana przez linię przerywaną. Krzywa C przedstawia reakcję z początkową fazą „lag”. Również w tym przypadku linia kropkowana przedstawia potencjalnie mierzalną aktywność. Wielokrotne oznaczanie stężenia produktu umożliwia wykreślenie każdej krzywej i określenie prawdziwej aktywności. Pojedyncze oznaczenie punktu końcowego w punkcie E prowadziłoby do fałszywego wniosku, że wszystkie trzy próbki miały identyczne stężenie enzymu.
.