Una noche en los estudios Mirage, en noviembre de 1983, Kevin Eastman y Peter Laird trabajaban intensamente en el último capítulo de su cómic Fugitoid cuando Eastman, movido por una inspiración desconocida, dibujó una «tortuga ninja» enmascarada y con nunchuck. Se lo enseñó a Laird, y los dos compartieron una carcajada por lo ridículo de la premisa.
«Pete dibujó uno más chulo», recuerda Eastman. «Luego, por supuesto, tuve que superar su boceto, así que dibujé a cuatro de ellos de pie en una pose dramática. Eso fue a lápiz, pero Pete lo entintó, y añadió ‘mutante adolescente’ a la parte de ‘tortuga ninja’. Nos estábamos meando en los pantalones esa noche, para ser honestos. Cuanto más lo pensaban, más potencial veían en el concepto. Cuando su trabajo en la primera historia de Fugitoid llegaba a su fin, la pareja decidió hacer de las Tortugas Ninja Adolescentes Mutantes su próximo proyecto de cómic. Inspirándose en algunos de sus cómics contemporáneos favoritos, como la épica aventura samurái Ronin de Frank Miller y su célebre carrera en Daredevil de Marvel Comics -junto con su amor mutuo por Jack Kirby-, se pusieron a trabajar en el desarrollo del universo de las Tortugas.
La historia de origen de las Tortugas Ninja Mutantes Adolescentes rindió homenaje al primer número de Daredevil de 1963, en el que el joven Matt Murdock queda ciego por un isótopo radiactivo mientras empuja a un anciano ciego del camino de un camión que se aproxima. Eastman y Laird extrapolaron que después de que el bote que contenía ese isótopo golpeara a Murdock, chocó con un transeúnte que llevaba una pecera con sus mascotas: cuatro tortuguitas. Las tortugas y el bote, que llevaba las iniciales T.C.R.I., cayeron por una rejilla a la alcantarilla de abajo, donde fueron descubiertas por una rata curiosa, Splinter. Splinter había sido la mascota del guerrero ninja exiliado Hamato Yoshi, que fue asesinado junto con su amante, Tang Shen, por el traicionero Oroku Saki, que culpaba a Yoshi de la muerte de su hermano, Oroku Nagi.
«El nombre de Splinter fue un guiño al personaje secundario de Daredevil, Stick», recuerda Laird, al hablar del maestro ninja creado por Miller que proporcionó al joven Matt Murdock las habilidades que necesitaría para luchar contra el crimen como Daredevil. «Creo que elegimos una rata porque cuando empezamos a trabajar en la historia del primer número de TMNT, sabíamos que gran parte de ella se desarrollaría en los desagües, las alcantarillas y los callejones de la ciudad, y pensamos que un habitante común de esos lugares era la humilde rata». Dado que La Mano amenazaba a Daredevil durante el mandato de Miller, era natural que las Tortugas se encontraran en conflicto con El Pie, un clan de ninjas cuyo líder, la Trituradora, no era otro que Oroku Saki. La Trituradora se inspiró en un rallador de queso metálico que a Eastman le pareció un arma potencial en manos de la persona equivocada.
Usando la copia de Laird de la Historia del Arte de Janson como inspiración, la pareja eligió nombres para las Tortugas de cuatro de sus artistas renacentistas favoritos: Leonardo, Miguel Ángel, Donatello y Rafael. Como las cuatro Tortugas tenían un aspecto prácticamente idéntico, sobre todo porque el libro se iba a publicar en blanco y negro, Eastman y Laird diferenciaron a las cuatro mediante la elección de sus armas: Leonardo blandía un par de katanas, Miguel Ángel usaba nunchakus, Donatello dominaba el bastón de mando y Rafael prefería el sais, un cuchillo. Y fue el Maestro Astilla, la rata mutada, quien se atribuyó el mérito de dar nombre a las Tortugas en el primer número. Sin embargo, el Maestro Astilla no era un maestro de la ortografía, ya que apodó «Miguel Ángel» a su alumno que empuñaba el nunchuck, un error ortográfico que se mantuvo en el personaje durante años.