Per studiare l’effetto dell’aumento della concentrazione dell’enzima sulla velocità di reazione, il substrato deve essere presente in una quantità eccessiva; cioè, la reazione deve essere indipendente dalla concentrazione del substrato. Qualsiasi cambiamento nella quantità di prodotto formato in un determinato periodo di tempo dipenderà dal livello di enzima presente. Graficamente questo può essere rappresentato come:
Queste reazioni sono dette di “ordine zero” perché i tassi sono indipendenti dalla concentrazione del substrato e sono uguali a una certa costante k. La formazione del prodotto procede a un tasso che è lineare con il tempo. L’aggiunta di più substrato non serve ad aumentare il tasso. Nella cinetica di ordine zero, permettendo al saggio di funzionare per il doppio del tempo si ottiene il doppio della quantità di prodotto.
| Ordine | Equazione del tasso | |
|---|---|---|
| zero | rate = k | rate è indipendente dalla concentrazione del substrato |
| primo | rate = k | rate è proporzionale alla prima potenza della concentrazione del substrato |
| secondo | rate = k=k2 | rate è proporzionale al quadrato della concentrazione del substrato |
| secondo | rate = k | il tasso è proporzionale alla prima potenza di ciascuno dei due reagenti |
La quantità di enzima presente in una reazione è misurata dall’attività che catalizza. La relazione tra attività e concentrazione è influenzata da molti fattori come la temperatura, il pH, ecc. Un test enzimatico deve essere progettato in modo che l’attività osservata sia proporzionale alla quantità di enzima presente in modo che la concentrazione dell’enzima sia l’unico fattore limitante. È soddisfatto solo quando la reazione è di ordine zero.
Nella figura 5, l’attività è direttamente proporzionale alla concentrazione nell’area AB, ma non in BC. L’attività enzimatica è generalmente massima quando la concentrazione del substrato è illimitata.
Quando la concentrazione del prodotto di una reazione enzimatica è tracciata contro il tempo, risulta una curva simile, Figura 6.
Tra A e B, la curva rappresenta una reazione di ordine zero; cioè, una in cui la velocità è costante con il tempo. Man mano che il substrato si esaurisce, i siti attivi dell’enzima non sono più saturi, la concentrazione del substrato diventa limitante, e la reazione diventa di primo ordine tra B e C.
Per misurare idealmente l’attività enzimatica, le misure devono essere fatte in quella porzione della curva in cui la reazione è di ordine zero. È molto probabile che una reazione sia inizialmente di ordine zero poiché la concentrazione del substrato è la più alta. Per essere certi che una reazione sia di ordine zero, devono essere effettuate più misurazioni della concentrazione del prodotto (o del substrato).
La figura 7 illustra tre tipi di reazioni che si possono incontrare nei saggi enzimatici e mostra i problemi che si possono incontrare se vengono effettuate solo singole misurazioni.
B è una linea retta che rappresenta una reazione di ordine zero che permette una determinazione accurata dell’attività enzimatica per una parte o per tutto il tempo della reazione. A rappresenta il tipo di reazione che è stato mostrato nella figura 6. Questa reazione è inizialmente di ordine zero e poi rallenta, presumibilmente a causa dell’esaurimento del substrato o dell’inibizione del prodotto. Questo tipo di reazione è a volte indicato come una reazione “leader”. La vera attività “potenziale” è rappresentata dalla linea tratteggiata. La curva C rappresenta una reazione con una fase iniziale di “ritardo”. Ancora una volta la linea tratteggiata rappresenta l’attività potenzialmente misurabile. Determinazioni multiple della concentrazione del prodotto permettono di tracciare ogni curva e di determinare la vera attività. Una singola determinazione del punto finale a E porterebbe alla falsa conclusione che tutti e tre i campioni hanno una concentrazione di enzima identica.