Voidaksemme tutkia entsyymikonsentraation kasvattamisen vaikutusta reaktionopeuteen, substraattia on oltava ylimääräinen määrä, eli reaktion on oltava riippumaton substraatin konsentraatiosta. Kaikki muutokset muodostuvan tuotteen määrässä tietyn ajan kuluessa riippuvat läsnä olevan entsyymin määrästä. Graafisesti tämä voidaan esittää seuraavasti:
Näiden reaktioiden sanotaan olevan ”nollakäskyisiä”, koska nopeudet ovat substraattikonsentraatiosta riippumattomia ja yhtä suuria kuin jokin vakio k. Tuotteen muodostuminen etenee nopeudella, joka on lineaarinen ajan suhteen. Substraatin lisääminen ei lisää nopeutta. Nollakäskykinetiikassa, jos määrityksen annetaan kestää kaksinkertainen aika, saadaan kaksinkertainen määrä tuotetta.
| järjestys | nopeusyhtälö | |
|---|---|---|
| nolla | nopeus = k | nopeus on riippumaton substraattikonsentraatiosta |
| ensimmäinen | nopeus = k | nopeus on verrannollinen substraattikonsentraation ensimmäiseen potenssiin |
| toinen | nopeus = k=k2 | nopeus on verrannollinen substraattikonsentraation neliöön |
| toinen | nopeus = k | nopeus on verrannollinen kummankin kahden reagoivan aineen ensimmäiseen potenssiin |
Reaktiossa olevan entsyymin määrää mitataan sen katalysoimalla aktiivisuudella. Aktiivisuuden ja konsentraation väliseen suhteeseen vaikuttavat monet tekijät, kuten lämpötila, pH jne. Entsyymimääritys on suunniteltava siten, että havaittu aktiivisuus on verrannollinen läsnä olevan entsyymin määrään, jotta entsyymin konsentraatio on ainoa rajoittava tekijä. Se täyttyy vain silloin, kun reaktio on nollajärjestyksessä.
Kuvassa 5 aktiivisuus on suoraan verrannollinen konsentraatioon alueella AB, mutta ei alueella BC. Entsyymiaktiivisuus on yleensä suurin, kun substraatin konsentraatio ei ole rajoittava.
Kun entsymaattisen reaktion tuotteen konsentraatio piirretään ajan suhteen, saadaan samanlainen käyrä, kuva 6.
Käyrä A:n ja B:n välillä edustaa nollakäyrästön reaktiota; eli reaktiota, jossa nopeus on vakio ajan suhteen. Kun substraatti kuluu loppuun, entsyymin aktiiviset paikat eivät ole enää kylläisiä, substraattikonsentraatiosta tulee nopeusrajoittava, ja reaktio muuttuu ensimmäisen kertaluvun reaktioksi B:n ja C:n välillä.
Jotta entsyymiaktiivisuutta voidaan mitata ihanteellisella tavalla, mittaukset on tehtävä käyrän siitä osasta, jossa reaktio on nollakäyrä. Reaktio on todennäköisimmin aluksi nollakäskyinen, koska substraattikonsentraatio on silloin suurin. Jotta voidaan olla varmoja siitä, että reaktio on nollakäyräinen, on tehtävä useita mittauksia tuotteen (tai substraatin) konsentraatiosta.
Kuvassa 7 havainnollistetaan kolmea reaktiotyyppiä, joita saattaa esiintyä entsyymimäärityksissä, ja osoitetaan ongelmat, joita saattaa esiintyä, jos tehdään vain yksittäisiä mittauksia.
B on nollakäyräinen reaktiota kuvaava suora viiva, jonka avulla voidaan määritellä entsyymin aktiivisuus täsmällisesti reaktioajalta tai sen ajalta. A edustaa kuvassa 6 esitettyä reaktiotyyppiä. Tämä reaktio on aluksi nollakäskyinen ja hidastuu sitten, mikä johtuu oletettavasti substraatin loppumisesta tai tuotteen estymisestä. Tämäntyyppistä reaktiota kutsutaan joskus ”johtavaksi” reaktioksi. Todellista ”potentiaalista” aktiivisuutta kuvaa katkoviiva. Käyrä C edustaa reaktiota, jossa on aluksi ”viiveinen” vaihe. Jälleen katkoviiva edustaa mahdollisesti mitattavaa aktiivisuutta. Tuotekonsentraation useat määritykset mahdollistavat kunkin käyrän piirtämisen ja todellisen aktiivisuuden määrittämisen. Yksittäinen loppupisteen määritys kohdassa E johtaisi väärään johtopäätökseen, että kaikissa kolmessa näytteessä olisi sama entsyymipitoisuus.