Human papilloomaviruksen korkea esiintyvyys kolorektaalisessa syövässä latinalaisamerikkalaisilla: A Case-Control Study

Abstract

Human papilloomaviruksen (HPV) rooli paksusuolen karsinogeneesissä on edelleen hämärän peitossa. Perustuen HPV:hen liittyvien pahanlaatuisten kasvainten suureen esiintyvyyteen puertoricolaisilla latinalaisamerikkalaisilla, tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan HPV-infektion ja viruksen integroitumisen esiintyvyyttä paksusuolen kudoksissa, jotta voitaisiin arvioida sen oletettua roolia paksusuolen syövässä (CRC). Tässä tapaus-verrokkitutkimuksessa HPV-infektion esiintyvyyttä CRC:ssä (tapaukset n = 45) ja syövästä vapaiden henkilöiden normaalissa paksusuolen limakalvossa (kontrollit n = 36) arvioitiin nested PCR-strategialla. HPV-16-genotyypin määritys tehtiin HPV-positiivisista kudoksista ja HPV-16-genomin fyysinen status määritettiin E2-ilmaisulla. HPV todettiin 19:ssä 45:stä (42,2 %) CRC-tapauksesta (keski-ikä 61,1 ± 10,7 vuotta, 24 miestä) ja 1:ssä 36:sta (2,8 %) kontrolliryhmästä (keski-ikä 60,9 ± 9,6 vuotta, 24 miestä), jolloin OR = 25,58 (95 % CI 3,21 – 203,49). HPV-16 havaittiin 63,2 prosentissa HPV-positiivisista kolorektaalikasvaimista; genomin integroitumista havaittiin kaikissa HPV-16-positiivisissa tapauksissa. Tämä on ensimmäinen raportti, jossa osoitetaan HPV-infektioiden suuri esiintyvyys Karibian latinalaisamerikkalaisten kolorektaalikasvaimissa. Huolimatta todisteista HPV:n integroitumisesta isännän genomiin on perusteltua tehdä lisää mekanistisia analyysejä, joissa tutkitaan HPV:n onkoproteiinien ilmentymistä ja näiden onkoproteiinien oletettua roolia kolorektaalikarsinogeneesissä.

1. Johdanto

Human papilloomavirus (HPV)-infektiot ovat yleisimpiä sukupuoliteitse tarttuvia infektioita Yhdysvalloissa (USA) (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). HPV:t ovat epiteeliotrooppisia, kaksijuosteisia DNA-viruksia, jotka infektoivat ihon limakalvosolujen levyepiteeliä. Viruksen lisääntyminen tapahtuu solujen tyvissä ja on tiukasti sidoksissa solun erilaistumistilaan. HPV:n genotyyppejä on reilusti yli 100. Tyypit 6, 11, 40 ja 42 liittyvät yleisesti hyvänlaatuisiin vaurioihin, ja ne luokitellaan matalan riskin tyyppeiksi. HPV-16:lla, HPV-18:lla, HPV-31:llä ja HPV-45:llä katsotaan olevan suuri onkogeeninen potentiaali, ja niitä kutsutaan korkean riskin tyypeiksi . HPV on todettu aiheuttajaksi kohdunkaulan , emättimen , peräaukon , suun ja peniksen syövissä. Tutkimukset ovat myös osoittaneet vahvoja korrelaatioita HPV:n ja monien syöpätyyppien, kuten ruokatorven , nielun ja kurkunpään, kehittymisen välillä. HPV-infektion oletettua roolia paksu- ja peräsuolen karsinogeneesissä ei kuitenkaan ole selvitetty kunnolla, ja se on edelleen kiistanalainen.

Karsinoidun peräsuolen syövän patogeneesi on ymmärretty paremmin molekyylitasolla; kuitenkin sen etiologia on edelleen puutteellisesti ymmärretty. Viime vuosikymmenen aikana useissa tutkimuksissa on ehdotettu, että HPV:llä saattaa olla merkitystä paksusuolen karsinogeneesissä . HPV:n havaitseminen paksusuolen kudoksesta on johtanut monenlaisiin töihin, joissa on ehdotettu syy-yhteyttä HPV:n ja CRC:n välille. HPV:n esiintyminen paksusuolen kudoksessa on edelleen erittäin kiistanalainen keskustelunaihe, koska tulosten toistettavuudessa on epäjohdonmukaisuuksia. Koska HPV-genomin integroituminen on välttämätöntä, jotta virus voi käyttää karsinogeenista potentiaaliaan, viruksen genomin fyysisen tilan arviointi HPV-infektion vahvistamisen jälkeen on olennaista syy-yhteyden toteamiseksi. E2-geenin inaktivoituminen genomin integroitumisen kautta edistää E6- ja E7-onkoproteiinien ilmentymistä, jotka vastustavat p53:n ja pRB:n toimintaa. Näiden onkoproteiinien välittämä p53:n ja pRB:n hajoaminen helpottaa viruksen DNA:n lisääntymistä isännässä ja johtaa neoplasiaan kirjallisuudessa hyvin kuvattujen mekanismien avulla.

CRC on vastuussa noin 694 000 kuolemantapauksesta maailmanlaajuisesti . Yhdysvalloissa CRC on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä ja kolmanneksi yleisin syöpäkuolemien syy . Puerto Ricossa (PR) CRC on toiseksi yleisin diagnosoitu ja johtava syöpäkuolemien syy miehillä ja naisilla . Puertoricolaisilla miehillä ja naisilla on raportoitu HPV:hen liittyvien syöpien suurta esiintyvyyttä ja HPV:n suurta esiintyvyyttä anogenitaalinäytteissä . HPV-16:n seroprevalenssin raportoitiin olevan 11,3 prosenttia PR:n aikuisten väestöpohjaisessa näytteessä, mikä on samanlainen kuin Yhdysvalloissa (11,5 prosenttia) . Näin ollen, kun otetaan huomioon korkea CRC-kuolleisuus ja HPV:hen liittyvien sairauksien suuri esiintyvyys PR:ssä, tämän tapaus-verrokkitutkimuksen yleistavoitteena oli arvioida CRC:n ja HPV-infektion välistä yhteyttä puertoricolaisista latinalaisamerikkalaisista otetuissa näytteissä.

2. Menetelmät

2.1. Tutkimusmenetelmät. Eettinen lausunto

Tämän tutkimuksen hyväksyi Puerto Ricon yliopiston lääketieteellisen tiedekampuksen IRB (#A7330109). Kaikki menettelyt olivat IRB:n eettisten standardien mukaisia.

2.2. Koehenkilöiden rekrytointi ja näytteenotto

Tapaukset ja kontrollit rekrytoitiin peräkkäin käyttäen tarkoituksenmukaista näytteenottoa, ja ne sovitettiin yhteen sukupuolen ja iän mukaan. Vähintään 21-vuotiaat tutkimukseen osallistujat rekrytoitiin, kun he kävivät Puerto Ricon lääketieteellisen keskuksen tiloissa kolonoskopiassa rutiiniseulonnan, oireiden ja/tai gastroenterologien ja kolorektaalikirurgien lähetteiden vuoksi. Tutkimuksen tarkoitus selitettiin, ja kaikki tutkimukseen osallistujat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen ennen tutkimukseen osallistumista. Kaikki tähän analyysiin osallistuneet olivat latinalaisamerikkalaisia. Latinalaisamerikkalaisuus määriteltiin osallistujan itse ilmoittaman perimän tai syntymäpaikan perusteella. Kaikkien tähän tutkimukseen osallistuneiden kontrollihenkilöiden paksusuolen tähystystulokset olivat normaalit. Henkilöillä, joilla oli CRC, oli histopatologisesti vahvistettu adenokarsinoomadiagnoosi. Tutkimushenkilöt, joilla oli perinnöllisiä syöpäoireyhtymiä ja tulehduksellinen suolistosairaus, jätettiin tutkimuksen ulkopuolelle.

Tuore pakastekudos saatiin 45:ltä ei-perinnölliseltä, sporadiselta CRC-potilaalta (tapaukset) ja 36:lta syövästä vapaalta henkilöltä (kontrollit). Kudokset kerättiin CRC-potilailta kasvaimen resektioleikkauksen yhteydessä. Anaali- tai perianaalikasvaimet ja kudosnäytteet henkilöiltä, jotka ilmoittivat olevansa HIV-positiivisia, jätettiin pois. Kasvaimen sijainti luokiteltiin proksimaaliseksi (cecumista distaaliseen poikittaiseen paksusuoleen), distaaliseksi (pernafleksuurasta sigmoidiseen paksusuoleen) tai peräsuoleen (paksusuolen viimeiset 20 cm). Kontrollinäytteet paksusuolen kudosbiopsioista otettiin distaalisesta paksusuolesta rutiinikolonoskopioiden yhteydessä.

Collaborative Family Registries’ Colorectal Cancer Risk Factor Questionnaire (http://coloncfr.org/) -lomakkeella (http://coloncfr.org/kyselylomake) jokaiselta potilaalta kerättiin kliiniset ja sosiodemografiset tiedot, mukaan lukien sukupuoli, elintavat, sairaushistoria ja suvussa esiintynyt syöpä. Tutkimuksessa analysoituja sosiodemografisia ja kliinisiä ominaisuuksia olivat sukupuoli (mies vs. nainen), mediaani-ikä (<61 vuotta vs. ≥61 vuotta), tyypin 2 DM-diagnoosi (kyllä vs. ei), minkä tahansa syövän perhehistoria (kyllä vs. ei) ja CRC:n perhehistoria (kyllä vs. ei). Sukuhistoria määritellään siten, että ensimmäisen, toisen tai kolmannen asteen sukulaisella on syöpä. Elämäntapaominaisuudet, joita analysoitiin tässä tutkimuksessa, olivat alkoholinkäyttö (koskaan vs. ei koskaan) ja tupakointi (koskaan vs. ei koskaan).

2.3. Elämäntapaominaisuudet. DNA:n uuttaminen

Genominen DNA (gDNA) uutettiin ≈100 mg:sta kudosta käyttämällä DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) -pakettia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Laadunvalvontaa varten gDNA:n eheyden arvioimiseksi käytettiin -aktiivigeenin PCR-monistusta; näytteet, joista ei voitu monistaa -aktiivigeeniä, suljettiin pois tutkimuksesta.

Näytteestä toiseen tapahtuvan ristikontaminaation minimoimiseksi toteutettiin seuraavat vakiomuotoiset varotoimenpiteet: kaikki välineet ja työpöydät pyyhittiin DNAZap-valmisteella (Ambion, Foster City, CA) ja sen jälkeen 10 %:lla valkaisuaineella (bleach) ja 70 %:lla ETOH:lla (ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH, ETOH. Jokaiseen näytteeseen käytettiin uusia, steriilejä teriä. Kudosten käsittely ja nukleotidien uuttaminen rajoitettiin enintään 10 näytteeseen päivässä. Noin 100 mg kustakin näytteestä koodattiin satunnaisesti sokkoutetusti ja käytettiin jatkoanalyyseihin.

2.4. HPV:n osoittaminen ja genotyypitys

Human HPV-DNA:n osoittaminen suoritettiin pesäkkeisellä PCR-strategialla, jossa käytettiin ulkoisina alukkeina PGMY09/PGMY11 ja sisäisinä alukkeina GP5+/GP6+ . Nämä alukkeet monistavat HPV L1 -konsensusaluetta, joka tunnistaa yli 25 HPV-tyyppiä. Kukin reaktio suoritettiin 25 μl:n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 200 ng gDNA:ta, 12,5 μl Bullseye HS-Taq 2x Master Mix -seosta (MidSci, St. Louis, MO) ja 100 nmol/l yhdistettyjä PGMY09/11-alukkeita. Käytettiin seuraavia olosuhteita: 15 minuuttia 95 °C:ssa, jonka jälkeen 35 sykliä, joissa kussakin 60 sekuntia 94 °C:ssa, 60 °C:ssa ja 72 °C:ssa, ja viimeinen pidennys 10 minuuttia 72 °C:ssa. Kaksi mikrolitraa ensimmäisestä PCR-reaktiosta käytettiin templaattina nested PCR:ssä. Nesteytetyn PCR:n olosuhteet olivat samat kuin ensimmäisen PCR-ajon, lukuun ottamatta annealing-lämpötilaa, joka oli 52 °C. Monistetut tuotteet elektroforeerattiin ja analysoitiin ChemiDoc-laitteella (Bio-Rad, Hercules, CA). Positiivisena kontrollina käytettiin puhdistetun pHPV-16-plasmidi-DNA:n (ATCC 45113D) osoittamista ja negatiivisena kontrollina vettä.

HPV-16-DNA:n genotyypin määritys suoritettiin HPV-16 E6:een kohdistuvilla tyyppispesifisillä alukkeilla. Ensimmäisessä ajossa käytettiin HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAGAAC-3′) ja Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTCTCTGGTTGC-3′) -alukkeita samoilla edellä kuvatuilla PCR-olosuhteilla lukuun ottamatta hehkutuslämpötilaa, joka oli 68 °C. Alukkeilla Pr106: 5′-GTTTCTCAGGACCCACACACAGGAGGAGC-3′ ja Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGGGGGTTT C-3′ suoritetun pesäkkäisen PCR:n olosuhteet olivat samat lukuun ottamatta annealing-lämpötilaa, joka oli 60 °C. Positiivisena kontrollina käytettiin puhdistettua pHPV-16-plasmidi-DNA:ta (ATCC 45113D) ja negatiivisena kontrollina vettä. Amplikonit elektroforeerattiin ja visualisoitiin kuvatulla tavalla. Kymmenen prosenttia pesäkkeellisellä PCR:llä testatuista näytteistä validoitiin ja vahvistettiin ulkoisesti Ponce School of Medicine & Health Sciences -yliopiston (Ponce, PR) AIDS-tutkimusohjelman laboratoriossa (Ponce, PR) käyttäen INNO-LiPA HPV Genotyping Extra -pakettia (Fujirebio, Gent, Belgia).

2.5. HPV:n fyysinen tila

HPV-16-genomin fyysinen tila määritettiin tarkastelemalla E2-sekvenssin eheyttä käyttämällä aiemmin kuvattua nested PCR-strategiaa . Kaikki HPV-16-DNA:ta sisältävät kasvaimet analysoitiin (). Nesteytetty PCR-analyysi suoritettiin käyttämällä kahta spesifisten HPV-16-alkuaineiden sarjaa, joihin kuului kaksi eteenpäin suuntautuvaa aluketta, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) ja Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′) sekä kaksi käänteisaloitinta, Pr128 (5′-GTCGCTCTCCTGTGGGTCCTG-3′) ja Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGTTGC-3′). Molemmat PCR:t suoritettiin samoissa aiemmin kuvatuissa olosuhteissa lukuun ottamatta hehkutuslämpötilaa, joka oli 60 °C. Amplikonit analysoitiin kuvatulla tavalla. Positiivisina kontrolleina käytettiin CaSki- (CRL-1550) ja SiHa- (HTB-35) ihmisen kohdunkaulan solulinjoista uutettua DNA:ta. PCR-tuotteen puuttuminen tulkittiin E2-sekvenssin katkeamiseksi ja viruksen DNA:n integroitumiseksi isännän genomiin. E2-amplikonien esiintyminen osoittaa episomaalisen HPV-16-genomin esiintymistä.

2.6. Tilastollinen analyysi

Tapausten ja kontrollien sosiodemografisia, kliinisiä ja elämäntapaan liittyviä ominaisuuksia kuvattiin käyttämällä taajuusjakaumia kategoristen muuttujien osalta ja yhteenvetomittareita kvantitatiivisten muuttujien osalta. Tutkimusryhmien vertailuun käytettiin kaksipuolisia testejä: kategorisille muuttujille käytettiin khiin neliö -testiä tai Fisherin tarkkaa testiä ja määrällisten muuttujien vertailuun Studentin -testiä tai Mann-Whitneyn testiä. Ehdottomia logistisia regressiomalleja käytettiin arvioimaan CRC:n OR 95 prosentin luotettavuudella suhteessa HPV-statukseen ja muihin muuttujiin. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS 17.0 (SPSS Inc.) ja Epi InfoTM 7 (CDC) -ohjelmilla.

3. Tulokset

3.1. Tulokset

3. Tutkimukseen osallistuneiden sosiodemografiset, elintapojen ja kliinisen historian ominaisuudet

Taulukossa 1 on esitetty tutkimusväestön (; 45 CRC-tapausta ja 36 kontrollia) demografiset ja kliiniset ominaisuudet. CRC-tapausten keski-ikä oli 61,1 vuotta (vaihteluväli 38-86 vuotta; 24 oli miehiä). Kontrolliryhmän keski-ikä oli 60,9 vuotta (vaihteluväli 42-85 vuotta; 15 oli miehiä). Kontrolliryhmään verrattuna CRC-tapaukset ilmoittivat todennäköisemmin, että suvussa oli esiintynyt CRC:tä (OR 0,29; 95 % 0,10-0,80). Tutkittavan ilmoittamien CRC:tä sairastavien perheenjäsenten iän osalta CRC-diagnoosin mediaani-ikä tapausten ja kontrolliryhmien sukulaisilla oli 60 vuotta. Tilastollisesti merkitseviä yhteyksiä ei havaittu, kun verrattiin tapauksia ja kontrolleja, joiden sukulaisilla oli todettu CRC ≥60-vuotiaana verrattuna <60-vuotiaisiin. Muita merkittäviä yhteyksiä ei havaittu.

3.2. Tutkimukseen osallistuneet henkilöt. HPV-DNA:n osoittaminen

Havaittiin merkittävä ero HPV-infektion esiintyvyydessä, kun verrattiin paksusuolen kasvainkudoksia ja kontrollien normaalia limakalvoa. HPV-DNA:ta havaittiin 19:ssä 45:stä (42,2 %) CRC-näytteestä ja yhdessä 36:sta (2,8 %) tutkitusta kontrollinäytteestä (kuva 1). HPV-infektio oli positiivisesti yhteydessä CRC:hen (OR 25,58; 95 % CI 3,22-203,49), (taulukko 2). HPV-positiivisuuden ja CRC:n välinen yhteys havaittiin kaikilla paksusuolen anatomisilla alueilla.

Kuvio 1

HPV:n osoitusmääritys. Tässä kuvassa on esitetty 12 edustavan tapauksen elektroforeettinen profiili, joka on määritetty nested PCR:llä HPV L1:n osoittamiseksi. Tapaukset 2, 4, 5, 6, 8 ja 10 ovat positiivisia, kuten GP 5+/6+ -aloitinparin tuottaman amplikonin läsnäolo osoittaa. Kaista M on molekyylikokomarkkeri; kaistat 13 ja 14 olivat HPV-positiivisia ja vesikontrolleja.

3.3. KUVA 3.1. Molekyylikokomarkkeri. HPV-positiivisten tapausten sosiodemografiset, elämäntapaan liittyvät ja kliinispatologiset ominaisuudet

HPV-positiivisten CRC-tapausten keski-ikä oli 60,3 vuotta (vaihteluväli 45-86 vuotta; 9 oli miehiä). HPV-positiivisen statuksen ja seuraavien seikkojen välillä ei havaittu merkittäviä yhteyksiä: sukupuoli, ikä, tupakan tai alkoholin käyttö, diabeteshistoria, minkä tahansa syövän esiintyminen suvussa tai CRC:n esiintyminen suvussa (taulukko 3). HPV-statuksen ja histologisen erilaistumisen, kasvaimen vaiheen tai sijainnin välillä ei havaittu merkittäviä yhteyksiä (taulukko 4).

3.4. Kolorektaalikasvainten kliinispatologiset ominaisuudet. HPV-16-genotyypin määritys ja virusfyysisen tilan arviointi

HPV-16 havaittiin 12:ssa 19:stä HPV-positiivisesta CRC-näytteestä (63,2 %); loput 7 (36,8 %) vastasivat muita HPV-genotyyppejä (epätyypillisiä). HPV-16:ta ei havaittu HPV-positiivisessa kontrollinäytteessä. HPV-16-positiivisten kasvainten jakaumat kasvaimen sijainnin suhteen olivat seuraavat: Näytteistä 33,3 % (4 näytettä 12:sta) todettiin proksimaalisessa paksusuolessa (paksusuolessa (cecum), nousevassa paksusuolessa ja poikittaisessa paksusuolessa), 50,0 % (6 näytettä 12:sta) todettiin distaalisessa paksusuolessa (pernaflexuurissa, laskevassa paksusuolessa ja sigmoideaalisessa paksusuolessa) ja 16,7 % (2 näytettä 12:sta) todettiin peräsuolessa. Muiden kuin HPV-16-kasvainten osalta 2 kasvainta 7:stä (28,6 %) sijaitsi distaalisessa paksusuolessa ja 5 kasvainta 7:stä (71,43 %) peräsuolessa. HPV-16-DNA:n fyysinen status CRC-kudoksissa määritettiin osoittamalla HPV-16 E2. Ehjää E2:ta vastaavaa amplikonia ei havaittu yhdessäkään HPV-16-positiivisessa tapauksessa, mikä osoittaa, että HPV-16-genomi oli integroitunut.

4. Pohdinta ja johtopäätökset

HPV:tä on havaittu paksusuolen kasvaimissa . HPV:n roolia kolorektaalikarsinogeneesissä ei kuitenkaan ole selvitetty, ja aihe on edelleen kiistanalainen. Tässä tutkimuksessa raportoimme tarkan arvioinnin HPV-infektioista paksusuolen kudoksissa (CRC-tapaukset ja normaalin limakalvon kontrollit) hyvin karakterisoidusta latinalaisamerikkalaisesta väestöstä, jolla on raportoitu olevan suuri HPV:hen liittyvien pahanlaatuisten sairauksien esiintyvyys ja korkea CRC-kuolleisuus . Lisäksi arvioitiin HPV-16-genotyypin määritys ja HPV-16-genomin fyysinen tila.

Analysoiduissa kasvainkudoksissa havaittiin suuri HPV-infektion esiintyvyys (42,2 %). Vain yksi 36:sta (2,8 %) kontrollinäytteestä oli positiivinen muulle kuin HPV-16-tyypille. Kohortissamme havaittu HPV-infektioiden esiintyvyys kolorektaalikasvaimissa on verrattavissa prosenttiosuuksiin, jotka on aiemmin raportoitu eri maissa tehdyissä tutkimuksissa, joissa on käytetty erilaisia kokeellisia lähestymistapoja . Immunohistokemiallinen analyysi formaliiniin kiinnitetyistä parafiiniin upotetuista (FFPE) kudosnäytteistä yhdysvaltalaisilta henkilöiltä (; 30 kontrollia, 30 adenoomaa ja 43 CRC:tä) osoitti HPV-DNA:ta 27 prosentissa adenoomista ja 69 prosentissa CRC:stä . Kiinalaisilta henkilöiltä otetuista FFPE-näytteistä saadun DNA:n HPV-tyyppispesifisissä PCR-analyyseissä havaittiin HPV:tä 29 %:ssa adenoomista () ja 53 %:ssa CRC:stä ( . Käyttämällä samaa tässä tutkimuksessa käytettyä pesäkkeisiin perustuvaa PCR-strategiaa yhdistettynä in situ -PCR:ään eräässä toisessa tutkimuksessa havaittiin HPV-dna:ta 51 %:ssa CRC-näytteistä (), mutta ei yhdysvaltalaisilta henkilöiltä saaduissa kontrollinäytteissä () . Muissa tutkimuksissa, joissa käytettiin samaa nested PCR -strategiaa argentiinalaisilta henkilöiltä otetuissa CRC-näytteissä, havaittiin HPV:tä 44 prosentissa CRC-näytteistä () . Pérez ym. (2005) raportoivat kuitenkin, että HPV:tä esiintyi 33 prosentissa tutkituista ei-neoplastisista kolorektaalikudoksista ( . Sen sijaan useissa tutkimuksissa HPV:tä ei ole pystytty havaitsemaan, ja niissä on esitetty, että HPV-infektio ei ole CRC:n riskitekijä .

HPV-16 on yleisin korkean riskin tyyppi Amerikassa . HPV-16:n on myös raportoitu olevan erittäin yleinen HPV:hen liittyvissä pahanlaatuisissa kasvaimissa PR:ssä, kuten pään ja kaulan sekä kohdunkaulan syövässä . Tutkimuksessamme HPV-16 oli yleisin havaittu korkean riskin HPV-tyyppi; HPV-16 esiintyi 63,2 prosentissa HPV-positiivisista CRC-näytteistä (12 näytettä 19:stä), mikä on verrattavissa joihinkin aiempiin raportteihin, joissa HPV-16 oli yleisin havaittu korkean riskin HPV-tyyppi. Vastaavasti HPV-positiivisten CRC-näytteiden analysoinnissa, jossa käytettiin PCR-pohjaista HPV-16-genotyypin määritysmenetelmää, havaittiin, että HPV-16 oli yleisin havaittu virustyyppi, sillä sitä esiintyi 41:ssä 60 tapauksesta (68,3 %). HPV-16-genotyypin määrityksessä, jossa käytettiin samoja tässä tutkimuksessa käytettyjä alukepareja, havaittiin HPV-16 36 prosentissa CRC-näytteistä () . Käyttämällä muita kuin PCR-pohjaisia HPV-16-genotyypin määritystekniikoita HPV-16 on löydetty 16-94 prosentissa HPV-positiivisista CRC-näytteistä .

Kirjallisuudessa esiintyvät ristiriitaisuudet, joissa raportoidaan HPV:n ja HPV-16:n havaitsemisesta paksu- ja peräsuolen kasvaimissa, johtuvat metodologisista eroista, mukaan lukien tutkimusasetelma, kudosnäytteen tyyppi, näytteen koko, näytteen keruu ja käytetyn HPV:n havaitsemis- tai genotyypitystekniikan herkkyyserot. Pakastettuja kudosnäytteitä käytettiin, koska uutettu DNA on laadultaan parempaa kuin FFPE:stä saatu DNA, joka hajoaa . Fiksaatiomenetelmä hajottaa DNA:n <200 bp:n fragmentteihin, mikä johtaa PCR-tuoton vähenemiseen ja kyvyttömyyteen monistaa pitkiä kohteita . Sen vuoksi FFPE:stä uutettu DNA ei ole optimaalinen analyyseissämme käytettyä nested PCR -strategiaa varten. PGMY/GP+-alkuaineyhdistelmä monistaa HPV L1:n (450 bp). Tämän alukeyhdistelmän on todettu olevan herkempi tyypille kuin MY/GP+-alukesarjojen, sillä se havaitsee laajemman valikoiman HPV-tyyppejä . Muita eroja HPV:n havaitsemisessa CRC:ssä on yhdistetty HPV-infektion esiintyvyyden alueellisiin vaihteluihin, joihin vaikuttaa tutkittavan rotu/etninen ja maantieteellinen tausta . Esimerkiksi HPV-18 havaitaan useimmin Aasiasta ja Euroopasta peräisin olevissa CRC-tapauksissa .

HPV:tä havaittiin CRC-kudoksissa useissa eri puolilta paksusuolta saaduissa kasvainnäytteissä. HPV havaittiin 21,05 %:ssa proksimaalisista kasvaimista, 42,11 %:ssa distaalisista kasvaimista ja 36,84 %:ssa peräsuolen kasvaimista. HPV-infektioiden laaja anatominen jakautuminen CRC:n kasvainkudoksessa viittaa siihen, että HPV-infektio CRC:ssä ei johdu viruksen retrogradisesta siirtymisestä anogenitaalialueelta. Näiden tulosten perusteella emme voi sulkea pois hematologisen leviämisen mahdollisuutta, kuten Bodaghi ym. ehdottivat. On näyttöä HPV-infektioista pikkulapsilla ja naispuolisilla yliopisto-opiskelijoilla, jotka eivät ole koskaan harrastaneet penetroivaa seksiä, mikä tukee sitä, että HPV:n leviäminen muita kuin seksuaalisia reittejä pitkin voi olla mahdollista. Vaikka HPV on sukupuolitauti, emme keränneet tietoja seksuaalisesta käyttäytymisestä, mikä olisi antanut meille mahdollisuuden arvioida, onko CRC:n ja seksuaalisen käyttäytymisen välillä yhteyttä.

Viruksen integroituminen isännän genomiin on kriittinen vaihe kohdunkaulan karsinogeneesissä. HPV:n integroitumista isännän genomiin on raportoitu noin 90 prosentissa kohdunkaulan karsinoomista. Näissä tapauksissa esiintyy E6- ja E7-viruksen onkogeenien ilmentymistä. HPV:n fyysinen tila voidaan havaita PCR-tuotteen puuttumisen perusteella, koska E2:n avoin lukukehys katkeaa, kun HPV integroituu isännän genomiin . Tämän menetelmän mahdollisia rajoituksia voivat olla seuraavat: määrityksellä voidaan havaita integroitunut virus-DNA vain silloin, kun episomaalista HPV-DNA:ta ei esiinny, sillä ei voida erottaa puhtaasti episomaalista ja sekamuotoista HPV:tä, eikä viruksen integroitumisen mahdollisuutta ilman E2-geenifragmentin häviämistä ole otettu huomioon. Tutkimuksessamme kaikissa testatuissa HPV-16-positiivisissa tapauksissa havaittiin kuitenkin integraatio, mikä sulkee pois episomaalisen genomin esiintymisen. HPV-16-genomin integroitumisen suuri prosenttiosuus isännän genomiin tukee mahdollisuutta, että HPV:llä voi olla rooli paksusuolen karsinogeneesissä. Vaikka tuloksemme ovatkin rohkaisevia, niitä on tulkittava varovaisesti. Huolimatta korkeariskisen HPV-tyypin (HPV-16) aiheuttaman infektion korkeasta esiintyvyydestä paksusuolen kasvaimissa ja todisteista viruksen genomin integroitumisesta, tulevissa tutkimuksissa on arvioitava, ovatko HPV-infektiot aktiivisia ja ekspressoituvatko onkoproteiinit E6 ja E7, jotta niillä olisi osuutta ja/tai kausaalista roolia paksusuolen karsinogeneesissä.

Tutkimuksessamme otoskoko on verrattain pieni, mikä voi rajoittaa ositettuja ja rajattuja analyysejä. Ne voivat johtaa joihinkin epätarkkoihin arvioihin (kuten leveät 95 prosentin luottamusvälit osoittavat). HPV:n ja CRC:n välisen yhteyden havaittujen kertoimien suuruus on kuitenkin hyvin suuri, eikä se todennäköisesti johdu tyypin I tilastollisesta virheestä. Tässä tutkimuksessa saadut tiedot yhdessä kirjallisuudessa esitettyjen raporttien kanssa eivät vielä riitä johtopäätökseen siitä, että HPV on Bradford Hillin syy-yhteyskriteerien mukaan CRC:n aiheuttaja. Viisi yhdeksästä kriteeristä täyttyy. (1) Vahvuus: Tässä tutkimuksessa ja kirjallisuudessa on raportoitu vahvoja tilastollisesti merkitseviä yhteyksiä . (2) Johdonmukaisuus: HPV on havaittu CRC:ssä muissa tutkimuksissa, joissa on käytetty samaa menetelmää . (3) Uskottavuus: HPV integroituu isännän genomiin ja ilmentää onkogeenisiä proteiineja, joiden tiedetään edistävän karsinogeneesiä . (4) Analogia: korkean riskin HPV:llä, kuten HPV-16:lla, on syy-yhteys muihin syöpiin, kuten kohdunkaulan syöpään . (5) Ajallisuus: HPV:tä on havaittu myös adenoomissa, CRC:n esiasteissa . Tarvitaan lisää pitkittäistutkimuksia, joissa arvioidaan HPV:n roolia paksu- ja peräsuolen karsinogeneesissä, jotta johdonmukaisuus- ja ajallisuuskriteeriä voidaan täysin tukea. Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa raportoidaan HPV-infektion yleisyydestä, HPV-16:n (korkean riskin tyypin) yleisyydestä ja HPV-16-genomin integroitumisesta Karibian latinalaisamerikkalaisten paksusuolen kasvainkudokseen. Lisäanalyysit ovat perusteltuja, jotta HPV:n ja CRC:n välinen syy-yhteys voidaan todeta.

Esintressiristiriita

Tekijät ilmoittivat, ettei eturistiriitoja ole.

Kiitokset

Tämä hanke sai tukea RCMI:n apurahasta G12MD007600 ja NIMHD:n apurahasta U54MD007587. Lisätukea antoivat NCI:n avustukset R21CA167220 ja U54CA096297. Kirjoittajat haluavat kiittää tohtori Ana Patricia Ortizia tämän artikkelin kriittisestä lukemisesta.