Om het effect van een verhoging van de enzymconcentratie op de reactiesnelheid te bestuderen, moet het substraat in overmaat aanwezig zijn; d.w.z. dat de reactie onafhankelijk moet zijn van de substraatconcentratie. Elke verandering in de hoeveelheid product die in een bepaalde tijdsperiode wordt gevormd, is afhankelijk van de hoeveelheid aanwezig enzym. Grafisch kan dit als volgt worden weergegeven:
Deze reacties worden “van nulorde” genoemd omdat de snelheid onafhankelijk is van de substraatconcentratie en gelijk is aan een constante k. De vorming van het product verloopt lineair met de tijd. De toevoeging van meer substraat verhoogt de snelheid niet. Bij een nul-orde kinetiek resulteert een verdubbeling van de tijd in een verdubbeling van de hoeveelheid product.
| Order | Snelheidsvergelijking | |
|---|---|---|
| nul | snelheid = k | snelheid is onafhankelijk van substraatconcentratie |
| eerste | snelheid = k | snelheid is evenredig met de eerste macht van substraatconcentratie |
| tweede | snelheid = k=k2 | snelheid is evenredig met het kwadraat van de substraatconcentratie |
| tweede | snelheid = k | snelheid is evenredig met de eerste macht van elk der twee reactanten |
De hoeveelheid enzym die in een reactie aanwezig is, wordt afgemeten aan de activiteit die het katalyseert. De verhouding tussen activiteit en concentratie wordt door vele factoren beïnvloed, zoals temperatuur, pH, enz. Een enzymtest moet zo worden ontworpen dat de waargenomen activiteit evenredig is met de hoeveelheid aanwezig enzym, zodat de enzymconcentratie de enige beperkende factor is. Hieraan wordt alleen voldaan als de reactie van nulorde is.
In figuur 5 is de activiteit recht evenredig met de concentratie in het gebied AB, maar niet in BC. De enzymactiviteit is in het algemeen het grootst wanneer de substraatconcentratie onbeperkt is.
Wanneer de concentratie van het product van een enzymreactie wordt uitgezet tegen de tijd, levert dat een soortgelijke kromme op, figuur 6.
Tussen A en B stelt de kromme een reactie van de nulorde voor; dat wil zeggen een reactie waarbij de snelheid constant is met de tijd. Naarmate het substraat wordt opgebruikt, zijn de actieve sites van het enzym niet langer verzadigd, wordt de substraatconcentratie snelheidsbeperkend en wordt de reactie eerste orde tussen B en C.
Om de enzymactiviteit idealiter te meten, moeten de metingen worden verricht in dat deel van de curve waar de reactie van de nulorde is. De kans dat een reactie aanvankelijk van nul orde is, is het grootst omdat de substraatconcentratie dan het hoogst is. Om er zeker van te zijn dat een reactie van nul orde is, moeten meerdere metingen van de product- (of substraat-)concentratie worden verricht.
Figuur 7 illustreert drie typen reacties die bij enzymtests kunnen worden aangetroffen en laat zien welke problemen zich kunnen voordoen als slechts één meting wordt verricht.
B is een rechte lijn die een reactie van nul orde voorstelt en waarmee de enzymactiviteit gedurende een deel van de reactietijd of de gehele reactietijd nauwkeurig kan worden bepaald. A staat voor het type reactie dat in figuur 6 is weergegeven. Deze reactie verloopt aanvankelijk in een nul-orde en vertraagt daarna, vermoedelijk door uitputting van het substraat of remming van het product. Dit type reactie wordt ook wel een “leidende” reactie genoemd. De ware “potentiële” activiteit wordt weergegeven door de stippellijn. Curve C is een reactie met een initiële “naijlende” fase. Ook hier geeft de stippellijn de potentieel meetbare activiteit weer. Meerdere bepalingen van de productconcentratie maken het mogelijk elke curve uit te zetten en de werkelijke activiteit te bepalen. Een enkele bepaling van het eindpunt bij E zou tot de onjuiste conclusie leiden dat alle drie monsters een identieke enzymconcentratie hadden.