Hoge prevalentie van humaan papillomavirus bij colorectale kanker bij Hispanics: A Case-Control Study

Abstract

De rol van het Humaan Papillomavirus (HPV) in colorectale carcinogenese blijft ongrijpbaar. Gebaseerd op de hoge incidentie van HPV-geassocieerde maligniteiten onder Puerto Ricaanse Hispanics, had deze studie tot doel de prevalentie van HPV-infectie en virale integratie in colorectale weefsels te bepalen om zo de vermeende rol in colorectale kanker (CRC) te evalueren. In deze case-control studie werd de prevalentie van HPV-infectie in CRC (gevallen n = 45) en normaal colonslijmvlies van kankervrije personen (controles n = 36) beoordeeld met een geneste PCR-strategie. HPV-16 genotypering werd uitgevoerd in HPV-positieve weefsels en de fysieke status van het HPV-16 genoom werd bepaald door E2-detectie. HPV werd gedetecteerd in 19 van 45 (42,2%) CRC-gevallen (gemiddelde leeftijd 61,1 ± 10,7 jaar, 24 mannen) en in 1 van 36 (2,8%) controles (gemiddelde leeftijd 60,9 ± 9,6 jaar, 24 mannen) met een OR = 25,58 (95% CI 3,21 tot 203,49). HPV-16 werd gedetecteerd in 63,2% van de HPV-positieve colorectale tumoren; genoomintegratie werd waargenomen in alle HPV-16 positieve gevallen. Dit is het eerste rapport dat de hoge prevalentie van HPV-infecties in Caraïbische Hispanic colorectale tumoren aantoont. Ondanks bewijs van HPV integratie in het gastheergenoom, is verdere mechanistische analyse van HPV oncoproteïne expressie en de vermeende rol van deze oncoproteïnen in colorectale carcinogenese gerechtvaardigd.

1. Inleiding

Human Papillomavirus (HPV) infecties zijn de meest voorkomende seksueel overdraagbare infecties in de Verenigde Staten (VS) (http://www.cdc.gov/std/hpv/STDFact-HPV.htm). HPV’s zijn epitheliotrope, dubbelstrengs DNA-virussen die de squameuze epithelia van mucosale cellen in de huid infecteren. De virusvermenigvuldiging vindt plaats in de celkernen en is nauw verbonden met de differentiatiestatus van de cel. Er zijn meer dan 100 genotypes van HPV. De typen 6, 11, 40 en 42 worden vaak in verband gebracht met goedaardige laesies en worden geclassificeerd als laag-risicotypen. HPV-16, HPV-18, HPV-31 en HPV-45 worden geacht een hoog oncogeen potentieel te bezitten en worden hoog-risicotypes genoemd. HPV is geïdentificeerd als een oorzakelijk agens bij baarmoederhals-, vaginale, anale, orale en peniskanker. Studies hebben ook sterke correlaties aangetoond tussen HPV en de ontwikkeling van vele soorten kanker zoals slokdarm , keelholte , en strottenhoofd . De vermeende rol van HPV-infectie in colorectale carcinogenese is echter niet goed opgehelderd en blijft nog steeds controversieel.

De pathogenese van CRC is beter begrepen op moleculair niveau; de etiologie van CRC is echter nog steeds onvolledig begrepen. In het laatste decennium hebben verschillende studies gesuggereerd dat HPV een rol zou kunnen spelen in de colorectale carcinogenese. Detectie van HPV in colonweefsel heeft geleid tot een breed scala van werkzaamheden waarin een oorzakelijk verband tussen HPV en CRC wordt voorgesteld. De aanwezigheid van HPV in colonweefsel blijft een zeer controversieel onderwerp van discussie wegens inconsistenties in de reproduceerbaarheid van de resultaten. Aangezien integratie van het HPV-genoom noodzakelijk is opdat het virus zijn carcinogeen potentieel kan uitoefenen, is beoordeling van de fysieke status van het viraal genoom na bevestiging van HPV-infectie essentieel om een oorzakelijk verband vast te stellen. Inactivatie van het E2-gen door genomische integratie bevordert de expressie van de E6- en E7-oncoproteïnen, die de functie van respectievelijk p53 en pRB tegengaan. De resulterende degradatie van p53 en pRB, gemedieerd door deze oncoproteïnen, vergemakkelijkt de virale DNA-proliferatie in de gastheer en leidt tot neoplasie door mechanismen die goed beschreven zijn in de literatuur.

CRC is verantwoordelijk voor ongeveer 694.000 sterfgevallen wereldwijd. In de VS is CRC de op twee na meest gediagnosticeerde kanker en de op twee na belangrijkste doodsoorzaak door kanker. In Puerto Rico (PR), CRC is de 2e meest gediagnosticeerde en de belangrijkste oorzaak van kanker dood onder mannen en vrouwen . Een hoge prevalentie van HPV-gerelateerde kankers en een hoge prevalentie van HPV in anogenitale monsters zijn gemeld onder Puerto Ricaanse mannen en vrouwen . De seroprevalentie van HPV-16 werd gerapporteerd als 11,3% in een bevolkingssteekproef van volwassenen in PR , wat vergelijkbaar is met die gerapporteerd in de VS (11,5%) . Gezien de hoge sterftecijfers van CRC en de hoge incidentie van HPV-gerelateerde morbiditeiten in PR, was het algemene doel van deze case-control studie het evalueren van de associatie tussen CRC en HPV-infectie in steekproeven van Puerto Ricaanse Hispanics.

2. Methoden

2.1. Ethische verklaring

Deze studie werd goedgekeurd door de IRB van de University of Puerto Rico Medical Sciences Campus (#A7330109). Alle procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van de IRB.

2.2. Werving van proefpersonen en monstername

Zieken en controles werden achtereenvolgens gerekruteerd door middel van gemakkelijke steekproeven en werden qua geslacht en leeftijd op frequentie gematcht. Deelnemers aan de studie van 21 jaar of ouder werden gerekruteerd wanneer zij de faciliteiten van het Puerto Rico Medisch Centrum bezochten voor colonoscopieën als gevolg van routinematige screening, symptomen, en/of verwijzingen door gastro-enterologen en colorectale chirurgen. Het doel van deze studie werd uitgelegd en alle studiedeelnemers gaven geïnformeerde toestemming voor inclusie. Alle in deze analyse opgenomen deelnemers waren Spaanstalig. Hispanic zijn werd gedefinieerd door de deelnemer’s zelf-gerapporteerde afkomst of geboorteplaats. Alle controlepersonen in deze studie hadden normale resultaten bij hun colonoscopie. Personen met CRC hadden een diagnose van adenocarcinoom bevestigd door histopathologie. Proefpersonen met erfelijke kankersyndromen en inflammatoire darmziekten werden uitgesloten.

Vers ingevroren weefsel werd verkregen van 45 niet-familiaire, sporadische CRC-patiënten (gevallen) en 36 kankervrije personen (controles). Weefsels werden geoogst van CRC patiënten tijdens tumor resectie chirurgie. Anale of perianale tumoren en weefselmonsters van personen die meldden HIV-positief te zijn, werden uitgesloten. De plaats van de tumor werd geclassificeerd als proximaal (van de blindedarm tot het distale transversale colon), distaal (van de buiging van de milt tot het sigmoïdale colon), of rectum (laatste 20 cm van het colon). Controle biopten van colorectaal weefsel werden verkregen uit het distale colon tijdens routine colonoscopieën.

Met behulp van de Collaborative Family Registries’ Colorectal Cancer Risk Factor Questionnaire (http://coloncfr.org/), werden klinische en sociodemografische gegevens verzameld van elke patiënt, waaronder geslacht, levensstijl, medische geschiedenis, en familiegeschiedenis van kanker. De sociodemografische en klinische kenmerken die in de studie werden geanalyseerd waren geslacht (man versus vrouw), mediane leeftijd (<61 jaar versus ≥61 jaar), type 2 DM diagnose (ja versus nee), familiegeschiedenis van enige vorm van kanker (ja versus nee), en familiegeschiedenis van CRC (ja versus nee). Familiegeschiedenis is gedefinieerd als het hebben van een eerstegraads, tweedegraads of derdegraads familielid met kanker. De leefstijlkenmerken die in deze studie werden geanalyseerd, waren alcoholgebruik (ooit versus nooit) en rookstatus (ooit versus nooit).

2.3. DNA-extractie

Genomisch DNA (gDNA) werd geëxtraheerd uit ≈100 mg weefsel met behulp van de DNA Isolation Kit for Cells and Tissues (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) volgens de instructies van de fabrikant. Voor kwaliteitscontroledoeleinden werd -actine gen PCR amplificatie gebruikt om de gDNA integriteit te beoordelen; monsters waarvan -actine niet kon worden geamplificeerd werden van de studie uitgesloten.

De volgende gestandaardiseerde voorzorgsmaatregelen werden genomen om monster-tot-monster kruisbesmetting te minimaliseren: alle instrumenten en werkbanken werden afgeveegd met DNAZap (Ambion, Foster City, CA), gevolgd door 10% bleekmiddel en 70% ETOH voorafgaand aan monster manipulatie. Voor elk monster werden nieuwe, steriele mesjes gebruikt. Weefselbewerking en nucleotide-extractie werden beperkt tot een maximum van 10 monsters per dag. Ongeveer 100 mg van elk monster werd op een blinde manier willekeurig gecodeerd en gebruikt voor verdere analyses.

2.4. HPV-detectie en genotypering

Humaan HPV-DNA-detectie werd uitgevoerd via een geneste PCR-strategie met PGMY09/PGMY11 als buitenste primers en GP5+/GP6+ als binnenste primers. Deze primers amplificeren een HPV L1-consensusregio waarmee meer dan 25 HPV-types kunnen worden gedetecteerd. Elke reactie werd uitgevoerd in een totaal volume van 25 μl met 200 ng gDNA, 12,5 μl Bullseye HS-Taq 2x Master Mix (MidSci, St. Louis, MO) en 100 nmol/L gepoolde PGMY09/11-primers. De volgende condities werden gebruikt: 15 minuten bij 95°C, gevolgd door 35 cycli van elk 60 seconden bij 94°C, 60°C en 72°C, met een laatste extensie van 10 minuten bij 72°C. Twee microliter van de eerste PCR-reactie werd gebruikt als sjabloon voor de geneste PCR. De condities voor de nested PCR waren identiek aan die van de eerste PCR-reactie, met uitzondering van de annealingtemperatuur, die 52°C bedroeg. Geamplificeerde producten werden geëlektroforeerd en geanalyseerd met een ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA). Detectie van pHPV-16 gezuiverd plasmide-DNA (ATCC 45113D) werd gebruikt als positieve controle en water als negatieve controle.

HPV-16 DNA-genotypering werd uitgevoerd met de type-specifieke primers gericht op HPV-16 E6 . HPV-16E6 Pr80 (5′-CTGACTCGAG/TTTATGCACCAAAAGAAC-3′) en Pr625 (5′-GATCAGTTGTCTCTGGTTGC-3′) primers werden gebruikt voor de eerste run, met dezelfde PCR-condities als hierboven beschreven met uitzondering van de annealingtemperatuur die 68°C bedroeg. De voorwaarden voor de geneste PCR met de primers Pr106: 5′-GTTTCAGGACCCACAGGAGC-3′ en Pr562: 5′-GTACTCACC CC/TGATTACAGCTGGGTTT C-3′ waren dezelfde, met uitzondering van de annealingtemperatuur die 60°C bedroeg. Als positieve en negatieve controles werden respectievelijk pHPV-16 gezuiverd plasmide DNA (ATCC 45113D) en water gebruikt. Amplicons werden geëlektroforeerd en gevisualiseerd zoals beschreven. Tien procent van de door nested PCR geteste monsters werden extern gevalideerd en bevestigd in het laboratorium van het AIDS Research Program van de Ponce School of Medicine & Health Sciences (Ponce, PR) met behulp van de INNO-LiPA HPV Genotyping Extra kit (Fujirebio, Gent, België).

2.5. HPV Physical Status

De fysieke status van het HPV-16 genoom werd bepaald door de integriteit van de E2-sequentie te onderzoeken met behulp van een eerder beschreven geneste PCR-strategie. Alle tumoren die HPV-16 DNA bevatten werden geanalyseerd (). Geneste PCR-analyse werd uitgevoerd met 2 sets specifieke HPV-16 primers, waaronder 2 forward primers, Pr7581 (5′-CACTGCTTGCCAACCATTCC-3′) en Pr7677 (5′-GCC AAC GCC TTA CAT ACC G-3′), en 2 omgekeerde primers, Pr128 (5′-GTCGCTCCTGTGGGTCCTG-3′) en Pr223 (5′-ACGTCGCAGTAACTGTTGC-3′). Beide PCR’s werden onder dezelfde eerder beschreven omstandigheden uitgevoerd, met uitzondering van de annealingtemperatuur die 60°C bedroeg. Amplicons werden geanalyseerd zoals beschreven. DNA afkomstig van CaSki (CRL-1550) en SiHa (HTB-35) menselijke baarmoederhalscellijnen werd als positieve controle gebruikt. De afwezigheid van PCR-product werd geïnterpreteerd als E2-sequentiedisruptie en integratie van viraal DNA in het gastheergenoom. De aanwezigheid van E2-amplicons wijst op de aanwezigheid van episomale HPV-16-genomen.

2.6. Statistische analyse

Sociodemografische, klinische en leefstijlkenmerken bij gevallen en controles werden beschreven met behulp van frequentieverdelingen voor categorische variabelen en samenvattende maten voor kwantitatieve variabelen. Tweezijdige tests werden gebruikt om studiegroepen te vergelijken: de chi-kwadraat test of Fisher’s exact test werd gebruikt voor categorische variabelen en Student’s -test of Mann-Whitney test om kwantitatieve variabelen te vergelijken. Onvoorwaardelijke logistische regressiemodellen werden gebruikt om de OR met 95% betrouwbaarheid van CRC in relatie tot HPV-status en andere variabelen te schatten. Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 17.0 (SPSS Inc.) en Epi InfoTM 7 (CDC).

3. Resultaten

3.1. De demografische en klinische kenmerken van de studiepopulatie (; 45 CRC gevallen en 36 controles) worden gepresenteerd in Tabel 1. De gemiddelde leeftijd van de CRC-gevallen was 61,1 jaar (variërend van 38 tot 86 jaar; 24 waren mannen). In de controlegroep was de gemiddelde leeftijd 60,9 jaar (variërend van 42 tot 85 jaar; 15 waren mannen). Vergeleken met de controles hadden CRC-gevallen meer kans om een familiegeschiedenis van CRC te rapporteren (OR 0,29; 95% 0,10-0,80). Wat betreft de leeftijd van de familieleden met CRC zoals opgegeven door de proefpersoon, was de mediane leeftijd van CRC-diagnose in de familieleden van gevallen en controles 60 jaar. Er werden geen statistisch significante associaties gevonden bij het vergelijken van gevallen en controles met familieleden gediagnosticeerd met CRC op ≥60 jaar versus <60 jaar. Er werden geen andere significante associaties gevonden.

Karakteristieken CRC gevallen (%) Controles (%) waarde Geslacht Mannelijk 24 (53.3) 15 (41.7) 0.30 Vrouw 21 (46.7) 21 (58.3) Referentie Leeftijdsmediaan 61 (38-86) 60 (42-85) 61 23 (51.1) 18 (50) 0.92 61 22 (48.9) 18 (50) Referentie Lifestyle Ooit sigaretten gerookt Ja 24 (53.3) 14 (38.9) 0.20 Nee 21 (46.7) 22 (61.1) Referentie Ooit alcohol gedronken Ja 25 (55.6) 15 (41.7) 0.21 Nee 20 (44.4) 21 (58.3) Referentie Clinische voorgeschiedenis diabetesdiagnose Ja 11 (25.6) 6 (17.1) 0.37 Nee 32 (74.4) 29 (82.9) Referentie Familiegeschiedenis van enige vorm van kanker Ja 32 (71,1) 29 (82,9) 0.22 Nee 13 (28,9) 6 (17,1) Referentie Familieanamnese van CRC Ja 8 (17.8) 15 (42.8) 0.01 Nee 37 (82.2) 20 (57.1) Referentie

Het aantal gevallen kan per categorie verschillen, afhankelijk van de beschikbaarheid van de informatie. waarden werden berekend met behulp van chi-kwadraat toetsen of Fisher’s exact toetsen, indien van toepassing.

Tabel 1

Samenvatting van demografische en klinische kenmerken van de deelnemers aan de studie.

3.2. HPV DNA Detectie

Een significant verschil in de prevalentie van HPV infectie werd waargenomen bij het vergelijken van colorectale tumorweefsels en normale mucosa van controles. HPV-DNA werd gedetecteerd in 19 van de 45 (42,2%) CRC-monsters en in 1 van de 36 (2,8%) onderzochte controlemonsters (figuur 1). HPV-infectie was positief geassocieerd met CRC (OR 25,58; 95% CI 3,22 tot 203,49), (Tabel 2). De associatie tussen HPV-positieve status en CRC werd waargenomen in alle anatomische regio’s van het colon.

Karakteristieken CRC-gevallen (%) Controls (%) waarde OR (95% CI) HPV-infectiestatus HPV (+) 19 (42.2) 1 (2,8) 25,58 (3,22-203,49) HPV (-) 26 (57,8) 35 (97.2) Referentie HPV-infectiestatus per colorectale subsite Proximaal HPV (+) 4 (8.9) 1 (2.8) 0.001 46.67 (3.71-1175.05) HPV (-) 3 (6.7) 35 (97.2) Referentie Distaal HPV (+) 8 (17.8) 1 (2,8) 25,46 (3,32-582,87) HPV (-) 11 (24,5) 35 (97.2) Referentie Rectum HPV (+) 7 (15.6) 1 (2.8) 0.002 20.42 (2.62-474.77) HPV (-) 12 (26,7) 35 (97,2) Referentie

waarden werden berekend met behulp van chi-kwadraat toetsen of Fisher’s exact toetsen, indien van toepassing. Mid- exacte methode; Fisher’s exacte test.

Tabel 2

Associatie tussen HPV-infectiestatus en CRC.

Figuur 1

HPV-detectietest. Deze figuur toont het elektrofotetische profiel van 12 representatieve gevallen die met een “nested PCR” zijn onderzocht op HPV L1. De gevallen 2, 4, 5, 6, 8 en 10 zijn positief, zoals blijkt uit de aanwezigheid van het amplicon dat wordt gegenereerd door het GP 5+/6+ primerpaar. Rij M is de marker voor de moleculaire grootte; rij 13 en 14 waren HPV-positieve en watercontroles, respectievelijk.

3.3. De gemiddelde leeftijd van de HPV-positieve CRC-gevallen was 60,3 jaar (variërend van 45 tot 86; 9 waren mannen). Er werden geen significante verbanden gevonden tussen HPV-positieve status en: geslacht, leeftijd, gebruik van tabak of alcohol, voorgeschiedenis van diabetes, familiegeschiedenis van enige vorm van kanker, of familiegeschiedenis van CRC (tabel 3). Er werden geen significante associaties waargenomen tussen HPV-status en histologische differentiatie, tumorstadium of locatie (tabel 4).

HPV (+) CRC (%) HPV (-) CRC (%) waarde OR (95% CI) Geslacht Man 9 (47.4) 15 (57,7) 0,49 0,66 (0,20-2,17) Vrouw 10 (52.6) 11 (42.3) Referentie Leeftijdsmediaan 59 (45-86) 61.5 (38-83) 61 8 (42.1) 15 (57.7) 0.30 0.53 (0.16-1.77) 61 11 (57.9) 11 (42.3) Referentie Levensstijl Ooit sigaretten gerookt Ja 9 (47.4) 15 (57.7) 0.49 0.66 (0.20-2.17) Nee 10 (52,6) 11 (42,3) Referentie Ooit alcohol gedronken Ja 9 (47.4) 16 (61,5) 0,35 0,56 (0,17-1,86) Nee 10 (52,6) 10 (38.5) Referentie Clinische voorgeschiedenis diabetesdiagnose Ja 4 (21.1) 7 (29.1) 0.73 0.65 (0.14-2.73) Nee 15 (78.9) 17 (70.8) Referentie Familiegeschiedenis van enige vorm van kanker Ja 16 (84,2) 16 (61,5) 0,10 3,33 (0,77-14.42) Nee 3 (15,8) 10 (38,5) Referentie Familiegeschiedenis van CRC Ja 3 (15.8) 5 (19,2) 0,79 (0,14-3,95) Nee 16 (84,2) 21 (80.8) Referentie

Het aantal gevallen kan per categorie verschillen, afhankelijk van de beschikbaarheid van de informatie. waarden werden berekend met behulp van chi-kwadraat toetsen of Fisher’s exact toetsen, indien van toepassing. Mid- exact methode; Fisher’s exact test.

Tabel 3

Samenvatting van de demografische, leefstijl- en klinische kenmerken van de CRC-gevallen naar HPV-status.

>

HPV (+) CRC (%) HPV (-) CRC (%) waarde OR (95% CI) Differentiatie Slechte 1 (5.3) 1 (3.8) 1.14 (0.03-47.21) Goed/matig 14 (73.7) 16 (61.5) Referentie Stage Gevorderd (III en IV) 7 (38.9) 6 (37,5) 0,93 1,06 (0,27-4,24) Vroeg (0, I, en II) 11 (61,1) 10 (62.5) Referentie Tumorlocatie Proximaal 4 (21.1) 3 (11.53) 0.43 2.04 (0.37-12.16) Distaal en rectum 15 (79.0) 23 (88.5) Referentie

Het aantal gevallen kan per categorie verschillen, afhankelijk van de beschikbaarheid van de informatie. waarden werden berekend met behulp van chi-kwadraat toetsen of Fisher’s exact toetsen, indien van toepassing. Mid- exacte methode; Fisher’s exacte test.

Tabel 4

Clinicopathologische kenmerken van colorectale tumoren naar HPV-status.

3.4. HPV-16 Genotypering en Beoordeling van Virale Fysieke Status

HPV-16 werd gedetecteerd in 12 van de 19 HPV-positieve CRC-monsters (63,2%); de overige 7 (36,8%) kwamen overeen met andere HPV-genotypen (niet getypeerd). HPV-16 werd niet gedetecteerd in het HPV-positieve controlemonster. De verdeling van HPV-16 positieve tumoren over de tumorlocatie was als volgt: 33,3% (4 van 12) van de monsters werd aangetroffen in het proximale colon (blindedarm, colon ascendens en colon transversus), 50,0% (6 van 12) werd aangetroffen in het distale colon (miltaire flexuur, colon descendens en colon sigmoïd), en 16,7% (2 van 12) werd aangetroffen in het rectum. Bij de niet-HPV-16 tumoren bevonden zich 2 van de 7 (28,6%) in het distale colon en 5 van de 7 (71,43%) in het rectum. De fysische status van HPV-16 DNA in CRC-weefsels werd bepaald door detectie van HPV-16 E2. Het amplicon dat overeenkomt met het intacte E2 werd in geen van de HPV-16 positieve gevallen gedetecteerd, wat erop wijst dat het HPV-16 genoom geïntegreerd was.

4. Discussie en Conclusies

HPV is gedetecteerd in colorectale tumoren . Echter, de rol van HPV in colorectale carcinogenese is niet opgehelderd en het onderwerp blijft controversieel. In het huidige onderzoek rapporteren wij een rigoureuze evaluatie van HPV infecties in colorectale weefsels (CRC gevallen en normale mucosa controles) van een goed gekarakteriseerde Hispanic populatie waarvan bekend is dat zij een hoge incidentie van HPV-geassocieerde maligniteiten en een hoog CRC sterftecijfer heeft. HPV-16 genotypering en de fysieke status van het HPV-16 genoom werden ook beoordeeld.

Een hoge prevalentie van HPV-infectie (42,2%) werd gedetecteerd in de geanalyseerde tumorweefsels. Slechts 1 van de 36 (2,8%) controlemonsters was positief voor een niet-HPV-16 type. De prevalentie van HPV-infecties in colorectale tumoren in ons cohort is vergelijkbaar met percentages die eerder werden gerapporteerd in studies uit verschillende landen waarbij verschillende experimentele benaderingen werden gebruikt. Immunohistochemische analyse van formaline gefixeerde paraffine-embedded (FFPE) weefselmonsters van personen in de VS (; 30 controles, 30 adenomen, en 43 CRC) ontdekten HPV DNA in 27% en 69% van de adenomen en CRC, respectievelijk . HPV-type-specifieke PCR-analyses van DNA van FFPE-monsters van Chinese personen detecteerden HPV in 29% van de adenomen () en in 53% van de CRC ( . Gebruikmakend van dezelfde geneste PCR-strategie als in deze studie in combinatie met in situ PCR, detecteerde een andere studie HPV-DNA in 51% van de CRC-monsters () en niet in controlemonsters () van personen in de VS . Andere studies die gebruik maakten van dezelfde nested PCR-strategie met CRC-monsters van Argentijnse personen detecteerden HPV in 44% van de CRC-monsters () . Pérez et al. (2005) meldden echter dat HPV aanwezig was in 33% van de onderzochte niet-neoplastische colorectale weefsels ( . Verschillende studies hebben daarentegen geen HPV aangetoond en hebben gesuggereerd dat HPV-infectie geen risicofactor is voor CRC .

HPV-16 is het meest voorkomende hoog-risicotype in Amerika . HPV-16 is ook gemeld als zeer prevalent in HPV-geassocieerde maligniteiten in PR zoals hoofd- en hals- en baarmoederhalskanker . In onze studie was HPV-16 het meest voorkomende gedetecteerde hoog-risico HPV-type; HPV-16 was aanwezig in 63,2% van de HPV-positieve CRC-monsters (12 van de 19), wat vergelijkbaar is met enkele eerdere rapporten waarin HPV-16 het meest voorkomende gedetecteerde hoog-risico HPV-type was. Evenzo werd bij analyse van HPV-positieve CRC-monsters met behulp van een op PCR gebaseerde HPV-16 genotyperingsmethode vastgesteld dat HPV-16 het meest frequent gedetecteerde virale type was, en aanwezig was in 41 van de 60 gevallen (68,3%). HPV-16 genotypering met dezelfde primerparen die in deze studie werden gebruikt, detecteerde HPV-16 in 36% van de CRC-monsters () . Met behulp van niet-PCR-gebaseerde HPV-16 genotyperingstechnieken is HPV-16 gevonden in 16-94% van de HPV-positieve CRC-monsters.

De discrepanties in de literatuur die de detectie van HPV en HPV-16 in colorectale tumoren rapporteren, kunnen worden toegeschreven aan methodologische verschillen, waaronder studieopzet, type weefselmonster, monstergrootte, monsterverzameling, en verschillen in de gevoeligheid van de gebruikte HPV-detectie of genotyperingstechniek. Ingevroren weefselmonsters werden gebruikt omdat het geëxtraheerde DNA van superieure kwaliteit is in vergelijking met DNA van FFPE, dat wordt afgebroken. De fixatieprocedure breekt het DNA af tot fragmenten <200 bp, wat resulteert in verminderde PCR-opbrengsten en het onvermogen om lange targets te amplificeren. Daarom is DNA geëxtraheerd uit FFPE niet optimaal voor de geneste PCR-strategie die in onze analyses wordt gebruikt. De combinatie PGMY/GP+ primerset amplificeert HPV L1 (450 bp). Deze primercombinatie is typegevoeliger gebleken dan de MY/GP+ primersets en detecteert een breder spectrum van HPV-types. Bijkomende verschillen in de detectie van HPV in CRC zijn in verband gebracht met regionale variaties in de prevalentie van HPV-infectie, die worden beïnvloed door de raciale/etnische en geografische achtergrond van de proefpersoon. HPV-18 wordt bijvoorbeeld het vaakst gedetecteerd in CRC-gevallen uit Azië en Europa .

HPV werd gedetecteerd in CRC-weefsels in meerdere tumormonsters verkregen in het hele colon. HPV werd gedetecteerd in 21,05% van de proximale tumoren, 42,11% van de distale tumoren, en 36,84% van de tumoren in het rectum. De brede anatomische verspreiding van HPV infecties in CRC tumorweefsel impliceert dat HPV infectie in CRC niet het resultaat is van een retrograde virale transmissie vanuit het anogenitale gebied. Gezien deze resultaten kunnen we de mogelijkheid van hematologische verspreiding, zoals gesuggereerd door Bodaghi et al. niet uitsluiten. Er zijn aanwijzingen voor HPV-infecties bij zuigelingen en vrouwelijke universiteitsstudenten die nooit penetratieve seks hebben gehad, wat ondersteunt dat HPV-overdracht via andere niet-seksuele routes kan bestaan. Hoewel HPV een seksueel overdraagbare aandoening is, hebben we geen informatie over seksueel gedrag verzameld, waardoor we hadden kunnen beoordelen of er een verband is tussen CRC en seksueel gedrag.

Virusintegratie in het gastheergenoom is een kritieke stap in de carcinogenese van baarmoederhalskanker. Integratie van HPV in het gastheergenoom is gerapporteerd in ongeveer 90% van de baarmoederhalscarcinomen. Deze gevallen vertonen expressie van de virale oncogenen E6 en E7. De fysieke status van HPV kan worden gedetecteerd door de afwezigheid van een PCR-product, aangezien het E2 open leesframe wordt verstoord wanneer HPV in het gastheergenoom integreert. Mogelijke beperkingen bij het gebruik van deze methode zijn onder meer de volgende: de test kan alleen geïntegreerd viraal DNA detecteren in afwezigheid van episomaal HPV-DNA, kan geen onderscheid maken tussen zuivere episomale en gemengde vormen, en de mogelijkheid van virale integratie zonder verlies van het E2-genfragment wordt niet in aanmerking genomen. In onze studie vertoonden alle geteste positieve gevallen van HPV-16 echter integratie, waardoor de aanwezigheid van episomale genomen wordt uitgesloten. Het hoge percentage van HPV-16 genoomintegratie in het gastheergenoom ondersteunt de mogelijkheid dat HPV een rol kan spelen in colorectale carcinogenese. Onze resultaten zijn weliswaar bemoedigend, maar moeten met de nodige voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Ondanks de hoge prevalentie van infectie in colorectale tumoren met een hoog-risico HPV-type (HPV-16) en bewijs van virale genoomintegratie, moeten toekomstige studies nagaan of de HPV-infecties actief zijn en of de oncoproteïnen E6 en E7 tot expressie komen om bij te dragen en/of een causale rol te spelen in colorectale carcinogenese.

Onze studie heeft een relatief kleine steekproefgrootte, wat een beperking kan zijn voor gestratificeerde en beperkte analyses. Dit zou kunnen resulteren in enkele onnauwkeurige schattingen (zoals blijkt uit de brede 95%-betrouwbaarheidsintervallen). Niettemin is de omvang van de waargenomen odds ratio’s voor de associatie tussen HPV en CRC zeer hoog en is het onwaarschijnlijk dat deze het gevolg zijn van een type I statistische fout. De in deze studie gegenereerde gegevens in combinatie met rapporten in de literatuur zijn nog niet voldoende om te concluderen dat HPV een veroorzaker is van CRC volgens Bradford Hill’s Criteria of Causation . Aan vijf van de 9 gestelde criteria wordt voldaan. (1) Sterkte: er zijn sterke statistisch significante associaties gerapporteerd in deze studie en in de literatuur . (2) Consistentie: HPV is gedetecteerd in CRC in andere studies waarbij dezelfde methodologie werd gebruikt . (3) Plausibiliteit: HPV integreert in het gastheergenoom en brengt oncogene eiwitten tot expressie waarvan bekend is dat ze carcinogenese bevorderen . (4) Analogie: hoog-risico HPV’s, zoals HPV-16, hebben een oorzakelijke rol bij andere kankers zoals baarmoederhalskanker . (5) Temporaliteit: HPV is ook gedetecteerd in adenomen, voorloper laesies van CRC . Bijkomende longitudinale studies die de rol van HPV tijdens colorectale carcinogenese evalueren zijn nodig om het criterium van consistentie en temporaliteit volledig te ondersteunen. Concluderend meldt deze studie een hoge prevalentie van HPV-infectie, een hoge prevalentie van HPV-16 (een hoog-risicotype), en integratie van het HPV-16 genoom in colorectaal tumorweefsel van Caribische Hispanics. Verdere analyses zijn gerechtvaardigd om een oorzakelijk verband tussen HPV en CRC vast te stellen.

Conflict of Interests

De auteurs verklaarden dat er geen belangenconflict is.

Acknowledgments

Dit project werd ondersteund door RCMI Grant G12MD007600 en Grant U54MD007587 van het NIMHD. Aanvullende steun werd verleend door subsidies R21CA167220 en U54CA096297 van het NCI. De auteurs willen Dr. Ana Patricia Ortiz bedanken voor het kritisch lezen van dit artikel.