Általában a kémiai vegyületek három elsődleges jellemzője használható a HPLC elválasztások létrehozásához. Ezek:
– Polaritás
– Elektromos töltés
– Molekulaméret
Először is nézzük meg a polaritást és azt a két elsődleges elválasztási módot, amely ezt a tulajdonságot kihasználja: a normálfázisú és a fordított fázisú kromatográfiát.
A polaritáson alapuló elválasztások
A molekula szerkezetét, aktivitását és fizikai-kémiai tulajdonságait az alkotó atomok elrendezése és a köztük lévő kötések határozzák meg. Egy molekulán belül bizonyos atomok sajátos elrendeződését, amely különleges tulajdonságokért és kiszámítható kémiai reakciókért felelős, funkciós csoportnak nevezzük. Ez a szerkezet gyakran meghatározza, hogy a molekula poláros vagy nem poláros. A szerves molekulákat osztályokba sorolják az egyes molekulák által tartalmazott fő funkciós csoport(ok) szerint. A polaritáson alapuló elválasztási módot alkalmazva a különböző típusú molekulák relatív kromatográfiás visszatartását nagyrészt e funkciós csoportok jellege és elhelyezkedése határozza meg. Amint a P. ábra mutatja, a molekulák osztályai a relatív visszatartásuk alapján a kromatográfiás polaritás tartományába vagy spektrumába rendezhetők az erősen poláros és az erősen nem poláros között.
P. ábra: Kromatográfiás polaritásspektrum az analit funkciós csoportja szerint
A víz poláris vegyület. A benzol nem poláris vegyület. A hasonló kromatográfiás polaritású molekulák általában vonzzák egymást; az eltérő polaritásúak sokkal gyengébb vonzást mutatnak, ha egyáltalán van ilyen, és akár taszíthatják is egymást. Ez lesz az alapja a polaritáson alapuló kromatográfiás elválasztási módoknak.
Egy másik módja a gondolkodásnak az ismert hasonlat: az olaj és a víz nem keveredik. A mágnesességtől eltérően, ahol az ellentétes pólusok vonzzák egymást, a polaritáson alapuló kromatográfiás elválasztások a hasonlóak közötti erősebb vonzástól és az ellentétek közötti gyengébb vonzástól függenek. Ne feledje: “A hasonló vonzza a hasonlót” a polaritáson alapuló kromatográfiában.
Figura Q: A mobil és állófázisok megfelelő kombinációja befolyásolja a polaritáson alapuló elválasztást
A kromatográfiás elválasztó rendszer kialakításához a mintában található különböző vegyületek számára versenyt teremtünk a különböző polaritású mobilfázis és állófázis kiválasztásával. Ekkor a mintában lévő, az állófázishoz hasonló polaritású vegyületek késleltetve lesznek, mert erősebben vonzzák őket a részecskék. Azok a vegyületek, amelyek polaritása hasonló a mozgófáziséhoz, előnyösen vonzódnak hozzá, és gyorsabban mozognak.
Az egyes vegyületek egyes fázisokhoz való relatív vonzásának különbségei alapján így az analitok sebességének változtatásával elválasztás jön létre.
Az R-1, R-2 és R-3 ábrák a mozgófázisok, állófázisok és mintaanalitok tipikus kromatográfiás polaritási tartományait mutatják. Vegyük sorra mindegyiket, hogy lássuk, hogyan választja ki a kromatográfus a megfelelő fázisokat a polaritáson alapuló HPLC-szeparáció eléréséhez szükséges vonzási verseny kialakításához.
R-1. ábra: Mobilfázis kromatográfiás polaritásspektrum
Az R-1. ábrán láthatóhoz hasonló skálát, amelyen néhány gyakori oldószert a relatív kromatográfiás polaritás sorrendjében helyezünk el, eluotróp sorozatnak nevezzük. Azok a mozgófázis molekulák, amelyek hatékonyan versenyeznek az analit molekulákkal a vonzó állófázis helyekért, kiszorítják ezeket az analiteket, így azok gyorsabban mozognak az oszlopon keresztül . A víz a mobilfázis-oldószer skála poláros végén helyezkedik el, míg a hexán, egy alifás szénhidrogén, a nem poláros végén. A kettő között az egyes oldószerek, valamint az egymással keverhető oldószer-keverékek az elúciós erősség sorrendjében helyezhetők el. Az, hogy a skála melyik vége jelenti a “legerősebb” mozgófázist, az állófázis felületének jellegétől függ, ahol az analitmolekulákért folytatott verseny zajlik.
R-2. ábra: Állófázis részecske kromatográfiás polaritásspektrum
A szilícium-dioxid aktív, hidrofil felülete savas szilanol funkciós csoportokat tartalmaz. Következésképpen az R-2. ábrán látható állófázis-skála poláris végére esik. A szilícium-dioxid felületének aktivitása vagy polaritása szelektíven módosítható kevésbé poláros funkciós csoportok kémiai kötésével . Az itt bemutatott példák közé tartoznak, a csökkenő polaritás sorrendjében, a szilícium-dioxidon lévő cianopropilszilil- , n-oktilszililil- és n-oktadecilszililil-részek. Ez utóbbi egy hidrofób , nagyon nem pólusos pakolás.
R-3. ábra: A vegyület/analit kromatográfiás polaritásspektruma
Az R-3. ábra megismétli a mintánk kromatográfiás polaritásspektrumát . A két fázis polaritásának figyelembevétele után tehát egy adott állófázishoz a kromatográfusnak olyan mozgófázist kell választania, amelyben az érdeklődésre számot tartó analitok visszamaradnak, de nem olyan erősen, hogy ne tudjanak eluálódni. A hasonló erősségű oldószerek közül a kromatográfus mérlegeli, hogy az analitok polaritásának és oldhatóságának finomabb különbségeit melyik fáziskombináció tudja a legjobban kihasználni a kromatográfiás rendszer szelektivitásának maximalizálása érdekében. A hasonló vonzza a hasonlót, de – amint azt az eddigi megbeszélésekből valószínűleg el tudja képzelni – a polaritáson alapuló elválasztás létrehozása a minta ismeretét és a különböző típusú analitekkel és retenciós módokkal kapcsolatos tapasztalatot feltételezi. Összefoglalva, a kromatográfus a megfelelően ellentétes polaritású mozgófázis és részecske állófázis legjobb kombinációját választja ki. Ezután, ahogy a minta analitjei áthaladnak az oszlopon, a hasonló vonzza a hasonlót szabály fogja meghatározni, hogy mely analitok lassulnak le, és melyek haladnak gyorsabban.
Normálfázisú HPLC
Tswett növényi kivonatok elválasztásaiban sikeresen használt poláros állófázist egy sokkal kevésbé poláros mobilfázissal. A kromatográfiának ez a klasszikus módja normálfázisúként vált ismertté.
S-1. ábra: Normálfázisú kromatográfia
Az S-1. ábra a három festékkel készült tesztkeverékünk normálfázisú kromatográfiás elválasztását ábrázolja. Az állófázis poláris, és a poláris sárga színezéket tartja vissza a legerősebben. A viszonylag nem poláris kék színezéket a mobil fázis, egy nem poláris oldószer nyeri a visszatartási versenyben, és gyorsan eluálódik. Mivel a kék színezék hasonlít leginkább a mozgófázisra , gyorsabban mozog. A szilikán végzett normálfázisú kromatográfiára jellemző, hogy a mobilfázis 100%-ban szerves anyag; vizet nem használunk.
Reversz-fázisú HPLC
A fordított fázisú kifejezés azt a kromatográfiás módot írja le, amely éppen az ellenkezője a normálfázisúnak, azaz egy poláris mobilfázis és egy nem poláris állófázis használata. Az S-2. ábra a fekete három színezék keverékének ilyen protokollal történő elválasztását szemlélteti.
S-2. ábra: Fordított fázisú kromatográfia
Most a legerősebben visszatartott vegyület a nem polárisabb kék színezék, mivel annak vonzása a nem poláris állófázishoz a legnagyobb. A poláros sárga színezéket, mivel gyengén visszatartott, a poláros, vizes mozgófázis nyeri a versenyt, a leggyorsabban mozog az ágyon keresztül, és a legkorábban eluálódik hasonló vonzza a hasonlót.
Most, mivel jobban reprodukálható és széles körben alkalmazható, a fordított fázisú kromatográfiát a HPLC-módszerek mintegy 75%-ánál alkalmazzák. A legtöbb ilyen protokoll mozgófázisként víz és egy keverhető, poláros szerves oldószer, például acetonitril vagy metanol vizes keverékét használja. Ez általában biztosítja az analitok megfelelő kölcsönhatását a nem poláros, hidrofób részecskefelülettel. A C18-kötésű szilícium-dioxid a fordított fázisú HPLC-töltet legnépszerűbb típusa.
A C. táblázat a két fő HPLC-elválasztási mód fázisjellemzőinek összefoglalóját mutatja be a polaritás alapján. Ne feledje, hogy ezeknél a polaritáson alapuló módoknál a hasonló vonzza a hasonlót.
C. táblázat: A polaritáson alapuló elválasztások fázisjellemzői
Hidrofil-interakciós kromatográfia
A HILIC a normálfázisú kromatográfia egyik változatának tekinthető. A normálfázisú kromatográfiában a mozgófázis 100%-ban szerves. A mozgófázisban és a poláros töltetű részecskék pórusaiban csak nyomokban van jelen víz. A poláris analitok erősen kötődnek a poláris állófázishoz, és előfordulhat, hogy nem eluálódnak.
Némi víz hozzáadása a szerves mozgófázishoz lehetővé teszi a normálfázisú üzemmódban erősen visszatartott poláris vegyületek elválasztását és eluálását . A víz, egy nagyon poláros oldószer, hatékonyan versenyez a poláros analitekkel az állófázisért. A HILIC izokratikus vagy gradiens elúciós módban is futtatható. A kezdetben a poláris csomagolóanyag részecskéihez vonzódó poláris vegyületek a mozgófázis polaritásának növelésével eluálódhatnak . Az elemeket a növekvő hidrofilitás sorrendjében eluáljuk . A mobilfázishoz puffereket vagy sókat lehet hozzáadni, hogy az ionizálható analiteket egy formában tartsák.
Hidrofób interakciós kromatográfia
A HIC a fordított fázisú kromatográfia egy típusa, amelyet nagy biomolekulák, például fehérjék elválasztására használnak. Általában kívánatos, hogy ezek a molekulák vizes oldatban maradjanak, elkerülve a szerves oldószerekkel vagy felületekkel való érintkezést, amelyek denaturálhatják őket. A HIC kihasználja a nagy molekulák hidrofób kölcsönhatását egy mérsékelten hidrofób állófázissal, pl. butilkötésű, nem pedig oktadecilkötésű szilícium-dioxiddal. Kezdetben a víz magasabb sókoncentrációja elősegíti a fehérjék visszatartását a pakoláson. A gradiens elválasztásokat jellemzően a sókoncentráció csökkentésével végzik. Ily módon a biomolekulák a növekvő hidrofóbitás sorrendjében eluálódnak.
Töltésen alapuló elválasztások:
A polaritáson alapuló elválasztásoknál a hasonlót a hasonló vonzza, az ellentéteseket pedig taszíthatja. Az ioncserélő kromatográfiában és más, elektromos töltésen alapuló elválasztásokban a szabály megfordul. A hasonlóak taszíthatják, míg az ellentétek vonzzák egymást. Az ioncserélő elválasztásokhoz használt állófázisokat a felületükön lévő savas vagy bázikus funkciók jellege és erőssége, valamint az általuk vonzott és visszatartott ionok típusa jellemzi. A kationcserét pozitív töltésű ionok negatív felületen történő megtartására és elválasztására használják. Ezzel szemben az anioncserét negatív töltésű ionok pozitív felületen történő megtartására és elválasztására használják. Mindegyik ioncseretípus esetében legalább két általános megközelítés létezik az elválasztásra és az elúcióra.
T. ábra: Ioncserélő kromatográfia
Az erős ioncserélők olyan funkciós csoportokat hordoznak, amelyek mindig ionizáltak. Általában gyenge ionok visszatartására és elválasztására használják őket. Ezeket a gyenge ionokat az állófázis helyeihez erősebben vonzódó ionokat tartalmazó mobilfázissal történő kiszorítással lehet eluálni. Alternatív megoldásként a gyenge ionok megtarthatók az oszlopon, majd semlegesíthetők a mobilfázis pH-értékének in situ megváltoztatásával, aminek következtében elveszítik vonzerejüket és eluálódnak.
A gyenge ioncserélők egy bizonyos pH-érték felett vagy alatt semlegesíthetők, és töltésük révén elveszítik ionmegkötő képességüket. Ha töltöttek, akkor erős ionok megtartására és elválasztására használják őket. Ha ezeket az ionokat nem lehet kiszorítással eluálni, akkor az állófázis cserélőhelyei semlegesíthetők, megszüntetve az ionos vonzást, és lehetővé téve a töltött analitok eluálását.
D. táblázat: Ioncserélő irányelvek
A gyenge ioncserélők semlegesítése esetén hidrofób vagy hidrofil kölcsönhatások révén megtarthatják és elválaszthatják a fajokat; ezekben az esetekben az eluálás erősségét a mobilfázis polaritása határozza meg . Így a gyenge ioncserélők vegyes üzemmódú elválasztásokhoz használhatók .
A D. táblázat az ioncsere fő kategóriáira vonatkozó irányelveket vázolja fel. Például egy erősen bázikus analit visszatartásához gyenge kationcserélő állófázisú részecskét használjunk pH > 7-nél; ez biztosítja a negatív töltésű részecskefelületet. Az erős bázis felszabadításához vagy eluálásához csökkentse a mobilfázis pH-ját 3 alá; ez eltávolítja a felületi töltést és kikapcsolja az ioncserélő visszatartási mechanizmust.
Megjegyezzük, hogy a pKa az a pH-érték, amelynél a funkciós csoport 50%-a ionizálódik és 50%-a semleges. A lényegében semleges vagy teljesen töltött analit- vagy részecskefelület biztosításához a pH-t a pKa értékénél legalább 2 egységgel magasabb értékre kell beállítani.
Ne használjunk erős kationcserélőt erős bázis visszatartására; mindkettő töltött marad és erősen vonzzák egymást, ami szinte lehetetlenné teszi a bázis eluálását. Csak úgy lehet eltávolítani, ha az erős kationcserélőt elárasztjuk egy olyan konkurens bázissal, amely még erősebb visszatartást mutat, és az aktív cserehelyekért folytatott verseny megnyerésével kiszorítja a keresett vegyületet. Ez a megközelítés a HPLC-ben és az SPE-ben ritkán praktikus vagy biztonságos.
A méret alapján történő elválasztás:
Az 1950-es években Porath és Flodin felfedezte, hogy a biomolekulákat méretük, nem pedig töltésük vagy polaritásuk alapján lehet elválasztani azáltal, hogy egy szabályozott porozitású, hidrofil dextrán polimeren keresztül vezetik vagy szűrik őket. Ezt az eljárást gélszűrésnek nevezték el. Később analóg sémát alkalmaztak szintetikus oligomerek és polimerek elválasztására, meghatározott pórusmérettartományú szerves polimer csomagolások segítségével. Ezt az eljárást gélpermeációs kromatográfiának nevezték el. A hasonló, szabályozott pórusú szilícium-dioxid-töltetekkel végzett elválasztásokat méret-kiválasztó kromatográfiának nevezték. Az 1963-ban bevezetett első kereskedelmi HPLC-berendezéseket GPC-alkalmazásokra tervezték .
Mindezeket a technikákat jellemzően olyan állófázisokon végzik, amelyeket olyan pórusméret-eloszlással szintetizáltak, amely lehetővé teszi, hogy az érdeklődő analitok a töltet pórustérfogatának nagyobb vagy kisebb részébe belépjenek, illetve onnan kizáródjanak. A kisebb molekulák az ágyon való áthaladás során a pórusok nagyobb részébe hatolnak be. A nagyobb molekulák csak egy bizonyos méret felett hatolhatnak be a pórusokba, így kevesebb időt töltenek az ágyban. A legnagyobb molekulák teljesen kizáródhatnak a pórusokból, és csak a részecskék között haladnak át, kis térfogatban nagyon gyorsan eluálódva. A mobil fázisokat két okból választják ki: egyrészt, hogy jó oldószerek legyenek az analitok számára, másrészt, hogy megakadályozzák az analitok és az állófázis felülete közötti kölcsönhatásokat. Ily módon a nagyobb molekulák eluálódnak először, míg a kisebb molekulák lassabban haladnak és később eluálódnak, az oldatban lévő méretük csökkenő sorrendjében. Ebből következik az egyszerű szabály: a nagyok jönnek ki először.
Mióta a polimer molekulatömegét összefüggésbe lehet hozni az oldatban lévő méretével, a GPC forradalmasította a polimerek molekulatömeg-eloszlásának mérését, ami viszont meghatározza azokat a fizikai jellemzőket, amelyek javíthatják vagy ronthatják a polimerek feldolgozását, minőségét és teljesítményét.
Következtetés
Következtetés