HPLC-erotustavat

Yleisesti HPLC-erotusten luomisessa voidaan käyttää kolmea kemiallisten yhdisteiden ensisijaista ominaisuutta. Ne ovat:

– Polariteetti
– Sähkövaraus
– Molekyylin koko

Käsitellään ensin polariteettia ja kahta ensisijaista erotusmuotoa, joissa tätä ominaisuutta hyödynnetään: normaalifaasikromatografiaa ja käänteisfaasikromatografiaa.

Polariteettiin perustuvat erotukset

Molekyylin rakenteensa, aktiviteettinsa ja fysikaalis-kemialliset ominaisuutensa määrittelevät molekyylin muodostavien atomien asettelu ja niiden väliset sidokset. Molekyylin sisällä tiettyjen atomien erityistä järjestelyä, joka on vastuussa erityisominaisuuksista ja ennustettavista kemiallisista reaktioista, kutsutaan funktionaaliseksi ryhmäksi. Tämä rakenne määrittää usein sen, onko molekyyli polaarinen vai pooliton. Orgaaniset molekyylit lajitellaan luokkiin sen mukaan, mitä pääasiallisia funktionaalisia ryhmiä kukin sisältää. Kun käytetään poolisuuteen perustuvaa erotustapaa, erityyppisten molekyylien suhteellinen kromatografinen retentio määräytyy suurelta osin näiden funktionaalisten ryhmien luonteen ja sijainnin perusteella. Kuten kuvassa P on esitetty, molekyylien luokat voidaan järjestää niiden suhteellisen retentioasteen perusteella kromatografisen polariteetin vaihteluvälille tai spektriin erittäin poolisesta erittäin poolittomaan.

Kuva P: Kromatografinen polariteettispektri analyytin funktionaalisen ryhmän mukaan

Vesi on poolinen yhdiste. Bentseeni on pooliton yhdiste. Molekyylit, joilla on samanlainen kromatografinen polariteetti, pyrkivät vetämään toisiaan puoleensa; molekyylit, joilla on erilainen polariteetti, vetävät toisiaan puoleensa paljon heikommin, jos vetovoima on ollenkaan, ja saattavat jopa hylkiä toisiaan. Tähän perustuvat kromatografiset erotustavat, jotka perustuvat poolisuuteen.

Toinen tapa ajatella asiaa on tuttu vertaus: öljy ja vesi eivät sekoitu keskenään. Toisin kuin magnetismissa, jossa vastakkaiset navat vetävät toisiaan puoleensa, polariteettiin perustuvat kromatografiset erotukset riippuvat samankaltaisten aineiden välisestä voimakkaammasta vetovoimasta ja vastakkaisten aineiden välisestä heikommasta vetovoimasta. Muista: ”Samankaltaiset vetävät toisiaan puoleensa” polariteettiin perustuvassa kromatografiassa.

Kuva Q: Liikkuvan ja paikallaan pysyvän faasin oikea yhdistelmä vaikuttaa polariteettiin perustuvaan erotteluun

Kromatografisen erottelujärjestelmän suunnittelemiseksi luomme kilpailua näytteen sisältämille erilaisille yhdisteille valitsemalla liikkuvan faasin ja paikallaan pysyvän faasin, joilla on erilaiset polariteetit. Tällöin näytteessä olevat yhdisteet, jotka ovat samankaltaisia poolisuudeltaan kuin stationäärifaasi, viivästyvät, koska ne vetävät voimakkaammin puoleensa hiukkasia. Yhdisteet, joiden polariteetti on samankaltainen kuin liikkuvan faasin polariteetti, vetävät sitä puoleensa ja liikkuvat nopeammin.

Tälla tavalla, perustuen eroihin kunkin yhdisteen suhteellisessa vetovoimassa kutakin faasia kohtaan, saadaan aikaan erottelu muuttamalla analyyttien nopeuksia.

Kuvissa R-1, R-2 ja R-3 on esitetty tyypilliset kromatografiset polariteettialueet liikkuville faaseille, stationaarisille faaseille ja näyteanalyyseille. Tarkastellaan kutakin vuorollaan, jotta nähdään, miten kromatografi valitsee sopivat faasit kehittääkseen vetovoimakilpailun, jota tarvitaan polariteettiin perustuvan HPLC-erotuksen aikaansaamiseksi.

Kuva R-1: Liikkuvan faasin kromatografinen polariteettispektri

Kuvassa R-1 esitetyn kaltaista skaalaa, johon jotkin yleiset liuottimet sijoitetaan kromatografisen polariteettispektrijärjestelmän suhteellisten polariteettien mukaisessa järjestyksessä, sanotaan eluotrooppiseksi sarjaksi. Liikkuvan faasin molekyylit, jotka kilpailevat tehokkaasti analyytin molekyylien kanssa houkuttelevista paikallaan pysyvän faasin paikoista, syrjäyttävät näitä analyyttejä, jolloin ne liikkuvat nopeammin kolonnin läpi . Vesi on liikkuvan faasin ja liuottimen asteikon polaarisessa päässä, kun taas heksaani, alifaattinen hiilivety, on poolittomassa päässä. Tässä välissä yksittäiset liuottimet sekä sekoittuvien liuottimien seokset voidaan sijoittaa eluution voimakkuuden mukaiseen järjestykseen. Se, kumpi asteikon pää edustaa ”vahvinta” liikkuvaa faasia, riippuu sen stationäärifaasin pinnan luonteesta, jossa kilpailu analyytin molekyyleistä tapahtuu.

Kuva R-2: Stationäärifaasipartikkelien kromatografinen polariteettispektri

Hiilidioksidin aktiivinen, hydrofiilinen pinta, jossa on happamia funktionaalisia silanoliryhmiä. Näin ollen se sijoittuu kuvassa R-2 esitetyn stationaarifaasiasteikon polaariseen päähän. Piidioksidin pinnan aktiivisuutta tai poolisuutta voidaan muuttaa valikoivasti sitomalla siihen kemiallisesti vähemmän poolisia funktionaalisia ryhmiä . Tässä esitettyjä esimerkkejä ovat, polariteetin vähenemisjärjestyksessä, piidioksidin syanopropyylisilyyli-, n-oktyylisilyyli- ja n-oktadekyylisilyyliryhmät. Jälkimmäinen on hydrofobinen , hyvin epäpolaarinen pakkaus.

Kuva R-3: Yhdisteen/analyytin kromatografinen polariteettispektri

Kuvassa R-3 toistetaan näytteemme kromatografinen polariteettispektri . Otettuaan huomioon molempien faasien polariteetin kromatografin on siis valittava tietylle stationäärifaasille sellainen liikkuva faasi, jossa kiinnostavat analyytit pidättyvät, mutta eivät niin voimakkaasti, ettei niitä voida eluoida. Kromatografi harkitsee, mikä faasiyhdistelmä voi parhaiten hyödyntää analyytin napaisuuden ja liukoisuuden hienovaraisempia eroja kromatografisen järjestelmän selektiivisyyden maksimoimiseksi. Samankaltaisuus vetää puoleensa samankaltaisuutta, mutta kuten tähänastisen keskustelun perusteella luultavasti voitte kuvitella, polariteettiin perustuvan erottelun luominen edellyttää näytteen tuntemusta ja kokemusta erityyppisistä analyytteistä ja retentiotiloista. Yhteenvetona voidaan todeta, että kromatografi valitsee parhaan mahdollisen yhdistelmän liikkuvasta faasista ja partikkelin stationäärifaasista, joiden polariteetit ovat sopivasti vastakkaiset. Sitten, kun näytteen analyytit liikkuvat kolonnin läpi, sääntö like attracts like määrittää, mitkä analyytit hidastuvat ja mitkä etenevät nopeammin.

Normaalifaasinen HPLC

Kasviuutteiden erotteluissa Tswett onnistui käyttämään polaarista stationäärifaasia paljon vähemmän polaarisen liikkuvan faasin kanssa. Tämä klassinen kromatografiatapa tuli tunnetuksi normaalifaasina.

Kuva S-1: Normaalifaasikromatografia

Kuvassa S-1 on esitetty normaalifaasikromatografinen erotus kolmiväriaineisesta testiseoksestamme. Stationäärifaasi on polaarinen ja pidättää voimakkaimmin polaarista keltaista väriainetta. Suhteellisen epäpolaarinen sininen väriaine voittaa retentiokilpailussa liikkuvan faasin, joka on epäpolaarinen liuotin, ja eluoituu nopeasti. Koska sininen väriaine muistuttaa eniten liikkuvaa faasia , se liikkuu nopeammin. Normaalifaasikromatografialle piidioksidilla on tyypillistä, että liikkuva faasi on 100-prosenttisesti orgaanista; vettä ei käytetä.

Käänteisfaasikromatografia

Käsitteellä käänteisfaasikromatografia kuvataan kromatografiamuotoa, joka on juuri päinvastainen kuin normaalifaasikromatografia, nimittäin polaarisen liikkuvan faasin ja ei-polaarisen paikallaan pysyvän faasin käyttäminen. Kuvassa S-2 havainnollistetaan mustan kolmiväriseoksen erottamista tällaisella protokollalla.

Kuva S-2: Käänteisfaasikromatografia

Nyt voimakkaimmin pidättyvä yhdiste on epäpolaarisempi sininen väriaine, koska sen vetovoima epäpolaariseen stationäärifaasiin on suurin. Polaarinen keltainen väriaine, joka on heikosti pidättynyt, voittaa kilpailussa polaarisen, vesipitoisen liikkuvan faasin, liikkuu nopeimmin pedin läpi ja eluoituu varhaisimmin samanlainen vetää samanlaista puoleensa.

Tänä päivänä käänteisfaasikromatografiaa käytetään noin 75 %:ssa kaikista HPLC-menetelmistä, koska se on helpommin toistettavissa ja sen sovellettavuus on laaja. Useimmissa näistä protokollista käytetään liikkuvana faasina veden ja sekoittuvan, polaarisen orgaanisen liuottimen, kuten asetonitriilin tai metanolin, vesiseosta. Näin varmistetaan yleensä analyyttien asianmukainen vuorovaikutus poolittoman, hydrofobisen hiukkaspinnan kanssa. C18-sidottu piidioksidi on suosituin käänteisfaasi-HPLC-pakkaustyyppi.

Taulukossa C esitetään yhteenveto faasin ominaisuuksista kahdessa tärkeimmässä HPLC-erotustilassa polariteetin perusteella. Muista, että näissä polariteettiin perustuvissa moodeissa samanlainen vetää puoleensa samanlaista.

Taulukko C: Polariteettiin perustuvien erotusten faasiominaisuudet

Hydrofiilinen interaktiokromatografia

HILIC voidaan nähdä normaalifaasikromatografian muunnelmana. Normaalifaasikromatografiassa liikkuva faasi on 100 % orgaaninen. Liikkuvassa faasissa ja polaaristen pakkauspartikkelien huokosissa on vain pieniä määriä vettä. Polaariset analyytit sitoutuvat voimakkaasti polaariseen stationäärifaasiin eivätkä välttämättä eluoidu.

Lisäämällä jonkin verran vettä orgaaniseen liikkuvaan faasiin on mahdollista erottaa ja eluoida polaarisia yhdisteitä, jotka pidättyvät voimakkaasti normaalifaasimoodissa . Vesi, joka on hyvin polaarinen liuotin, kilpailee tehokkaasti polaaristen analyyttien kanssa stationäärifaasista. HILIC-menetelmää voidaan käyttää joko isokraattisessa tai gradienttieluutiossa. Polaariset yhdisteet, jotka aluksi vetävät puoleensa polaarisen pakkausmateriaalin hiukkasia, voidaan eluoida, kun liikkuvan faasin polariteettia lisätään. Analyytit eluoituvat hydrofiilisyyden lisääntymisjärjestyksessä. Liikkuvaan faasiin voidaan lisätä puskureita tai suoloja, jotta ionisoituvat analyytit pysyvät yhdessä muodossa.

Hydrofobinen interaktiokromatografia

HIC on eräänlainen käänteisfaasikromatografia, jota käytetään suurten biomolekyylien, kuten proteiinien, erottamiseen. Nämä molekyylit halutaan yleensä pitää koskemattomina vesiliuoksessa välttäen kosketusta orgaanisten liuottimien tai pintojen kanssa, jotka voisivat denaturoida ne. HIC-menetelmässä hyödynnetään suurten molekyylien hydrofobista vuorovaikutusta kohtalaisen hydrofobisen stationäärifaasin, esim. butyylisidoksisen , pikemminkin kuin oktadekyylisidoksisen , piidioksidin kanssa. Aluksi korkeammat suolapitoisuudet vedessä kannustavat proteiineja pidättäytymään pakkaukseen. Gradienttierotukset tehdään tyypillisesti alentamalla suolapitoisuutta. Näin biomolekyylit eluoituvat lisääntyvän hydrofobisuuden mukaisessa järjestyksessä.

Lataukseen perustuvat erotukset:

Polariteettiin perustuvissa erotteluissa samankaltainen vetää puoleensa samankaltaista ja vastakohtaiset saattavat hylkiä toisiaan. Ioninvaihtokromatografiassa ja muissa sähkövaraukseen perustuvissa erotteluissa sääntö on päinvastainen. Samankaltaiset voivat hylkiä toisiaan, kun taas vastakohdat vetävät toisiaan puoleensa. Ioninvaihto-erotuksissa käytettäville stationäärisille faaseille on ominaista niiden pinnalla olevien happamien tai emäksisten toimintojen luonne ja voimakkuus sekä ionityypit, joita ne vetävät puoleensa ja pidättävät. Kationinvaihtoa käytetään positiivisesti varautuneiden ionien pidättämiseen ja erottamiseen negatiivisella pinnalla. Vastaavasti anioninvaihtoa käytetään negatiivisesti varautuneiden ionien pidättämiseen ja erottamiseen positiivisella pinnalla. Jokaisella ioninvaihtotyypillä on ainakin kaksi yleistä lähestymistapaa erottamiseen ja eluointiin.

Kuva T: Ioninvaihtokromatografia

Vahvat ioninvaihtimet kantavat funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat aina ionisoituneita. Niitä käytetään tyypillisesti heikkojen ionien pidättämiseen ja erottamiseen. Nämä heikot ionit voidaan eluoida syrjäyttämällä ne liikkuvalla faasilla, joka sisältää ioneita, jotka vetävät voimakkaammin puoleensa stationäärifaasin paikkoja. Vaihtoehtoisesti heikot ionit voidaan pidättää pylvääseen, minkä jälkeen ne neutraloidaan muuttamalla liikkuvan faasin pH-arvoa in situ, jolloin ne menettävät vetovoimansa ja eluoituvat.

Heikot ioninvaihtimet voivat neutraloitua tietyn pH-arvon ylä- tai alapuolella ja menettää kykynsä pidättää ioneja varauksen perusteella. Varautuneina niitä käytetään vahvojen ionien pidättämiseen ja erottamiseen. Jos näitä ioneja ei voida eluoida syrjäyttämällä, stationäärifaasin vaihtokohdat voidaan neutraloida, jolloin ionien vetovoima katkeaa ja varautuneet analyytit voivat eluoitua.

Taulukko D: Ioninvaihto-ohjeita

Mikäli heikot ioninvaihtimet ovat neutraloituneet, ne voivat pidättää ja erottaa lajeja hydrofobisten tai hydrofiilisten vuorovaikutusten avulla; näissä tapauksissa eluution voimakkuus määräytyy liukuvan faasin polariteetin mukaan . Näin ollen heikkoja ioninvaihtimia voidaan käyttää sekamuotoisiin erotteluihin .

Taulukossa D esitetään ioninvaihdon pääluokkien suuntaviivat. Esimerkiksi vahvasti emäksisen analyytin pidättämiseksi käytetään heikon kationinvaihtajan stationäärifaasipartikkelia pH > 7:ssä; tämä takaa negatiivisesti varautuneen partikkelipinnan. Vahvan emäksen vapauttamiseksi tai eluoimiseksi laske liikkuvan faasin pH-arvo alle 3; tämä poistaa pinnan varauksen ja sammuttaa ioninvaihtosäilytysmekanismin.

Huomaa, että pKa on pH-arvo, jossa 50 % funktionaalisesta ryhmästä on ionisoitunut ja 50 % on neutraali. Jotta analyytin tai hiukkasen pinta olisi olennaisesti neutraali tai täysin varautunut, pH-arvo on säädettävä vähintään 2 yksikköä pKa:n yläpuolelle.

Ei saa käyttää vahvan kationin vaihtajaa vahvan emäksen pidättämiseen; molemmat jäävät varautuneiksi ja vetävät toisiaan voimakkaasti puoleensa, jolloin emäksen eluoituminen on lähes mahdotonta. Se voidaan poistaa vain peittämällä vahva kationinvaihtaja kilpailevalla emäksellä, jolla on vielä voimakkaampi retentio ja joka syrjäyttää kiinnostavan yhdisteen voittamalla kilpailun aktiivisista vaihtopaikoista. Tämä lähestymistapa on harvoin käytännöllinen tai turvallinen HPLC:ssä ja SPE:ssä.

Kokoon perustuvat erotukset: Porath ja Flodin havaitsivat 1950-luvulla, että biomolekyylit voidaan erottaa pikemminkin niiden koon kuin varauksen tai polariteetin perusteella johtamalla tai suodattamalla ne kontrolloidun huokoisuuden omaavan, hydrofiilisen dekstraanipolymeerin läpi. Tätä prosessia kutsuttiin geelisuodatukseksi. Myöhemmin vastaavaa järjestelmää käytettiin synteettisten oligomeerien ja polymeerien erottamiseen käyttämällä orgaanisia polymeeripakkauksia, joiden huokoskoko vaihtelee. Tätä prosessia kutsuttiin geelipermeaatiokromatografiaksi. Samankaltaisia erotteluja, joissa käytettiin kontrolloidun huokoisuuden omaavia piidioksidipakkauksia, kutsuttiin kokoekskluusiokromatografiaksi . Ensimmäiset kaupalliset HPLC-laitteet, jotka otettiin käyttöön vuonna 1963, suunniteltiin GPC-sovelluksia varten.

Kaikki nämä tekniikat tehdään tyypillisesti pysyvillä faaseilla, jotka on syntetisoitu siten, että niiden huokoskokojakauma on sellainen, että halutut analyytit pääsevät sisään tai suljetaan ulos suuremmasta tai pienemmästä osasta pakkauksen huokostilavuutta. Pienemmät molekyylit läpäisevät enemmän huokosia kulkiessaan alustan läpi. Suuremmat molekyylit voivat tunkeutua vain tietyn koon ylittäviin huokosiin, joten ne viettävät vuoteessa vähemmän aikaa. Suurimmat molekyylit voivat jäädä kokonaan huokosten ulkopuolelle ja kulkeutua vain hiukkasten väliin, jolloin ne eluoituvat hyvin nopeasti pieneen tilavuuteen. Liikkuvat faasit valitaan kahdesta syystä: ensinnäkin ne ovat hyviä analyyttien liuottimia ja toiseksi ne voivat estää analyyttien ja pysyvän faasin pinnan väliset vuorovaikutukset. Näin suuremmat molekyylit eluoituvat ensin, kun taas pienemmät molekyylit kulkeutuvat hitaammin ja eluoituvat myöhemmin liuoksessa olevan kokonsa mukaisessa järjestyksessä. Tästä seuraa yksinkertainen sääntö: isot tulevat ensin ulos.

Koska polymeerin molekyylipaino on mahdollista suhteuttaa sen kokoon liuoksessa, GPC mullisti polymeerien molekyylipainojakauman mittaamisen, joka puolestaan määrittää fysikaaliset ominaisuudet, jotka voivat parantaa tai heikentää polymeerin käsittelyä, laatua ja suorituskykyä.

Johtopäätökset