Pro studium vlivu zvýšení koncentrace enzymu na rychlost reakce musí být substrát přítomen v nadměrném množství, tj. reakce musí být nezávislá na koncentraci substrátu. Jakákoli změna v množství produktu vzniklého za určitou dobu bude záviset na množství přítomného enzymu. Graficky to lze znázornit takto:
Říká se, že tyto reakce mají „nulový řád“, protože rychlosti jsou nezávislé na koncentraci substrátu a jsou rovny určité konstantě k. Tvorba produktu probíhá rychlostí, která je lineární s časem. Přidání většího množství substrátu neslouží ke zvýšení rychlosti. V případě kinetiky nulového řádu vede ponechání testu běžet po dvojnásobnou dobu k dvojnásobnému množství produktu.
| Řád | Rychlostní rovnice | |
|---|---|---|
| nulová | rychlost = k | rychlost je nezávislá na koncentraci substrátu |
| první | rychlost = k | rychlost je úměrná první mocnině koncentrace substrátu |
| druhá | rychlost = k=k2 | rychlost je úměrná kvadrátu koncentrace substrátu |
| druhá | rychlost = k | rychlost je úměrná první mocnině každého ze dvou reaktantů |
Množství enzymu přítomného v reakci se měří aktivitou, kterou katalyzuje. Vztah mezi aktivitou a koncentrací je ovlivněn mnoha faktory, jako je teplota, pH atd. Enzymová zkouška musí být navržena tak, aby pozorovaná aktivita byla úměrná množství přítomného enzymu, aby koncentrace enzymu byla jediným limitujícím faktorem. To je splněno pouze tehdy, když je reakce nulového řádu.
Na obrázku 5 je aktivita přímo úměrná koncentraci v oblasti AB, ale ne v oblasti BC. Aktivita enzymu je obecně největší, když je koncentrace substrátu nelimitující.
Pokud se koncentrace produktu enzymatické reakce vynese do grafu v závislosti na čase, vznikne podobná křivka, obrázek 6.
Křivka mezi oblastmi A a B představuje reakci nulového řádu; to znamená takovou, při níž je rychlost konstantní s časem. Jak se substrát spotřebovává, aktivní místa enzymu již nejsou nasycena, koncentrace substrátu se stává limitující pro rychlost a reakce mezi B a C se stává reakcí prvního řádu.
Pro ideální měření aktivity enzymu je třeba provádět měření v té části křivky, kde je reakce nulového řádu. Reakce je s největší pravděpodobností zpočátku nulového řádu, protože koncentrace substrátu je tehdy nejvyšší. Aby bylo jisté, že reakce je nulového řádu, musí se provést více měření koncentrace produktu (nebo substrátu).
Obrázek 7 znázorňuje tři typy reakcí, se kterými se lze setkat při enzymových testech, a ukazuje problémy, na které lze narazit, pokud se provádí pouze jednotlivá měření.
B je přímka představující reakci nulového řádu, která umožňuje přesné stanovení aktivity enzymu po část nebo po celou dobu reakce. A představuje typ reakce, který byl znázorněn na obrázku 6. Tato reakce má zpočátku nulový řád a poté se zpomaluje, pravděpodobně v důsledku vyčerpání substrátu nebo inhibice produktu. Tento typ reakce se někdy označuje jako „vedoucí“ reakce. Skutečná „potenciální“ aktivita je znázorněna přerušovanou čarou. Křivka C představuje reakci s počáteční „opožděnou“ fází. Opět tečkovaná čára představuje potenciálně měřitelnou aktivitu. Vícenásobné stanovení koncentrace produktu umožňuje vykreslit každou křivku a určit skutečnou aktivitu. Jediné stanovení koncového bodu v bodě E by vedlo k nesprávnému závěru, že všechny tři vzorky měly stejnou koncentraci enzymu.
.