PMC

Den nyligen publicerade artikeln av Dayan och Wraith i den här tidskriften belyste utmaningarna med att utveckla nya immunterapier efter den katastrofala studien av TGN1412. I denna översikt presenteras en del av den kunskap som erhållits från många kliniska prövningar av anti-D och som kan vara relevant för translationell immunologi.

Förebyggande av hydrops fetalis eller Rhesus hemolytisk sjukdom hos foster och nyfödda (HDFN) med profylaktisk anti-D är den mest framgångsrika kliniska tillämpningen av antikroppsmedierad immunosuppression. HDFN uppstår när en D-negativ kvinna blir immuniserad mot fetala D-positiva röda blodkroppar efter en fetomaternal blödning (FMH). Det IgG anti-D som produceras överförs över placenta och förstör de fetala röda blodkropparna genom makrofager i mjälten. På 1940-talet, när orsaken till denna sjukdom först erkändes, föddes 1 % av barnen med HDFN och 40 % av dem dog. Anti-D är den vanligaste inblandade antikroppen. RhD-polypeptiden på röda blodkroppar är den mest immunogena av blodgruppsantigenerna eftersom den saknas i celler från D-negativa individer som saknar RHD-genen .

HDFN är numera sällsynt, delvis på grund av förbättrad foster- och neonatalvård, men framför allt på grund av att man förebygger primär immunisering av mottagliga D-negativa kvinnor med profylaktisk IgG anti-D . Sedan 1968, efter framgångsrika kliniska försök i Storbritannien och USA, har anti-D givits till 10 % av alla kvinnor postnatalt, vilket har lett till en minskning av sjukdomsförekomsten med cirka 95 %. Färre än 30 perinatala dödsfall per år orsakas nu av HDFN. År 2002 rekommenderade National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE) att rutinmässig antenatal anti-D-profylax skulle ges till alla D-negativa kvinnor, utöver postnatal profylax, för att minska immuniseringsgraden ytterligare. Intravenös (IV) anti-D används nu också terapeutiskt för att behandla vissa D-positiva patienter med immun trombocytopenisk purpura (ITP) . Efterfrågan på anti-D ökar således.

Anti-D immunglobulin framställs av poolad hyperimmun mänsklig plasma. Under många år har frågor om virologisk säkerhet och, på senare tid, variant Creutzfeld Jacobs sjukdom (vCJD) stimulerat sökandet efter alternativa leveranser. I Storbritannien kommer plasma för fraktionering nu från nordamerikanska donatorer på grund av farhågor om att brittiska donatorer skulle vara latenta bärare av vCJD. I syfte att ersätta polyklonala anti-D som framställts från mänsklig plasma med biotekniska versioner för både diagnostisk och klinisk användning har hundratals monoklonala (mAb) eller rekombinanta (rAb) anti-D-antikroppar framställts. De härrör alla från mänskliga immunglobulingener eller B-celler eftersom möss inte känner igen RhD-antigenet. Olika uttryckssystem har använts, bland annat mänskliga B-cellinjer, CHO-celler (Chinese hamster ovary), heterohybridom från mus och människa och myelom från råtta.

Och även om den exakta mekanismen för undertryckande av D-immunisering genom administrering av passiva IgG anti-D ännu inte har klarlagts, vet man att D-positiva röda blodkroppar snabbt avlägsnas från mjälten av makrofager via IgG Fc-receptor (FcγR)-interaktioner och blir icke-immunogena. För att säkerställa att profylaktisk anti-D sannolikt är effektiv för att förhindra D-immunisering till en stor FMH, testas kvinnorna 2-3 dagar senare för att kontrollera att fostercellerna rensas från cirkulationen . I övrigt har allogena röda blodkroppar en lång överlevnad efter FMH eller transfusion. Alloimmuna svar utvecklas långsamt, vanligtvis 5-15 veckor för anti-D . Detta beror förmodligen på att de saknar farosignaler (från främmande molekyler) så att de inte känns igen av immunsystemet förrän de blir senescenta, vilket då stimulerar deras fagocytos via fosfatidylserinreceptorer . Utan RhD-profylax blir cirka 17 % av D-negativa kvinnor immuniserade efter graviditet med ett D-positivt foster . Denna incidens är lägre än för avsiktligt immuniserade normalpersoner (upp till cirka 85 % svar ) eftersom volymerna av FMH för de flesta kvinnor är för små för att de röda blodkropparna ska vara immunogena . Gravida kvinnor kan ge robusta alloimmuna svar samtidigt som de tolererar sitt semi-allogena foster.

Under de senaste 20 åren har 19 anti-D mAbs och rAbs testats i 15 först-i-man-studier. Dessa granskades nyligen och sammanfattas här. Inga allvarliga biverkningar förekom. Biologiska in vitro-analyser av FcγR-medierad fagocytos och hemolys med hjälp av mänskliga effektorceller är väletablerade och användes för screening. I de kliniska prövningarna bedömdes antikropparnas förmåga att avlägsna små volymer (mindre än 1 %) av D-positiva röda blodkroppar från cirkulationen, och i vissa studier fastställdes sedan även anti-D:s förmåga att förhindra D-immunisering. Många av mAbs och rAbs jämfördes direkt med polyklonalt anti-D.

En stor heterogenitet i antikropparnas effektivitet observerades (tabell 1). Två mAbs som härstammar från humana B-lymphoblastoidcellinjer, BRAD-3 och BRAD-5, förmedlade snabb rötcellsclearance och förhindrade D-immunisering nästan lika effektivt som polyklonalt anti-D, även om en tre- till fyrfaldigt högre dos användes . Plasmahalveringstiden för BRAD-3 och BRAD-5 var normal, men biotillgängligheten var hälften så lång som för polyklonalt anti-D . När dessa antikroppar uttrycktes som rAbs i CHO-celler var clearance av autologa D-positiva röda blodkroppar långsammare än de ursprungliga mAbs . En stor studie där man använde ett annat CHO-derivat anti-D rAb, MonoRho, gav nedslående resultat, där clearance av röda blodkroppar var extremt varierande, vanligtvis mycket långsam och utan någon korrelation med anti-D-dosen . Den mycket låga biotillgängligheten hos MonoRho kan delvis förklara detta. Försökspersonerna producerade dock inte anti-D, även om de inte fick utmaningsinjektioner med D-positiva röda blodkroppar för att fastställa deras D-immuniseringsstatus . MAbs producerade av murina myelomcellinjer (som mus-humana heterohybridom) visade också stor variation i clearance av röda blodkroppar, men oväntat nog blev över hälften av mottagarna snabbt D-immuniserade , dubbelt så många som skulle inträffa med enbart röda blodkroppar . Dessa anti-D hade alltså en adjuvant effekt och förstärkte immunsvaret mot D-positiva röda blodkroppar i stället för att förhindra det som det var tänkt. Senare studier med anti-D rAbs producerade av myelomceller från råttor visade att de främjade en extremt snabb eliminering av autologa röda blodkroppar, snabbare än polyklonala anti-D . Effekten av att ändra cellinjen som uttrycker FOG-1 från mus till råtta var slående, och förändrade clearance från mycket långsam och ofullständig till mycket snabb. I den sistnämnda studien var detta förknippat med hemolys, viss avgång till levern och febrila reaktioner. Dessa reaktioner förekommer inte efter profylax med polyklonalt anti-D. Oväntat nog gav mutanter av FOG-1 rAb, som saknade FcγR-interaktioner in vitro, också upphov till snabb eliminering av röda blodkroppar, trots att man hade förväntat sig normal överlevnad . Dessa IgG anti-D måste ha bundit till andra receptorer än IgG FcγR.

Många av anti-D-mab- och rAb-ämnena betedde sig inte som polyklonalt anti-D. Ingen var riktigt lika effektiv och vissa från cellinjer från gnagare resulterade till och med i oönskade immunsvar. Reaktionerna in vivo bestämdes huvudsakligen av arten av den cellinje som producerade antikropparna och inte av proteinsekvenserna. Orsaken till dessa oväntade och eventuellt skadliga reaktioner kan bero på att IgG anti-D som producerats från djurceller interagerade med komponenter i det medfödda immunsystemet. Den mest sannolika förklaringen är variation i deras oligosackaridsammansättning.

Typen av glykosylering av IgG beror på den cell i vilken den produceras och är artspecifik. Strukturer som N-glykolylneuraminsyra och oligosackarider med hög mannosegrad på IgG från gnagare kan kännas igen som främmande av det medfödda immunförsvarets mönsterigenkänningsreceptorer (PRRs) med efterföljande proinflammatoriska reaktioner. PRR:erna omfattar bland annat cellulära asialoglykoprotein- och mannosereceptorer. Efter att ha bundit anti-D på D-positiva röda blodkroppar kan de ha stimulerat antikroppssvar mot D-antigenet. I plasma kan mannanbindande lektin orsaka komplementmedierad hemolys när det är bundet till mannosrester av anti-D på en erytrocyt. Endogena IgG-antikroppar som känner igen galaktos-α1,3-galaktos på murint IgG kan binda anti-D som uttrycker denna oligosackarid. Nyligen har endogena IgE-anti-galaktos-α1,3-galaktos orsakat överkänslighetsreaktioner hos vissa patienter som fått cetuximab (ett immunoterapeutiskt cancermedel) producerat i SP2/0-celler från myelom i mus. Brist på sialinsyra på många anti-D mAbs och rAbs skulle göra IgG pro-inflammatoriskt vid bindning av FcγR .

Polyklonalt anti-D kan vara antingen fördelaktigt eller dödligt i olika kliniska situationer. Dosen av röda blodkroppar som är måltavlor är en viktig faktor. Clearance av små volymer av röda blodkroppar, som vid FMH, är en ”tyst”, icke-inflammatorisk, icke hemolytisk process. Om en D-positiv person däremot får stora doser anti-D, som hos ett foster som lider av RhD-hemolytisk sjukdom eller, i sällsynta fall, ITP-patienter som behandlas med intravenöst anti-D, kan allvarlig hemolys inträffa. I dessa ibland dödliga fall är ytterligare symtom vanligtvis hydrops (ödem) hos HDFN och akut hemoglobinemi, hemoglobinuri och disseminerad intravaskulär koagulation hos ITP-patienter . De flesta fall av akut hemolys ansågs bero på kraftig extravaskulär hemolys (makrofagmedierad) snarare än intravaskulär hemolys . Även i avsaknad av sådana allvarliga biverkningar upplever ITP-patienter inte sällan feber och frossa efter infusion av intravenös anti-D , vilket tyder på inflammatoriska reaktioner. Om ITP-patienter behandlas med proinflammatoriska anti-D mAbs eller rAbs i stället för det nuvarande polyklonala anti-D, kan en komplex serie oavsiktliga och potentiellt farliga reaktioner följa.

I efterdyningarna av fas 1-studien TGN1412 kan vissa aspekter av de kliniska prövningarna av anti-D vara till hjälp för den framtida utvecklingen och regleringen av första-till-människa-studier av andra immunterapeutiska läkemedel, särskilt sådana som är inriktade på celler i blodet (tabell 2). Valet av startdos är särskilt viktigt. Låga doser av röda blodkroppar och anti-D användes i alla studier på människor. I vissa studier, t.ex. för BRAD-3 , belades autologa röda blodkroppar (0-5 ml) med anti-D ex vivo och tvättades sedan och injicerades, vilket minimerade dosen av antikroppar och minskade risken för biverkningar. Det är möjligt att noggrant följa hur sådana små volymer av röda blodkroppar försvinner när de är isotopmärkta. När denna antikropp visade sig vara säker och effektiv injicerades sedan anti-D och röda blodkroppar separat för att bättre simulera den kliniska situationen. Bevis på inflammatoriska reaktioner med låga doser av anti-D och röda blodkroppar bör leda till försiktighet vid uppskalningsstudier.

Slutsats, De omfattande uppgifterna från studier på människor av anti-D mAbs och rAbs tyder på att deras glykosylering kan ha haft en kraftfull effekt när det gäller att modulera deras in vivoaktiviteter. Vissa rAbs ökade snarare än minskade förekomsten av D-immunisering, en orsakade skadliga hemolytiska reaktioner och en hade extremt låg biotillgänglighet. Dessa effekter kunde inte förutsägas utifrån de in vitro-studier som utförts. I framtiden bör man vid utveckling av rekombinanta glykoproteiner för behandling av människor ta hänsyn till möjligheten att interaktioner mellan icke-mänskliga oligosackarider och andra celler eller molekyler än den avsedda liganden kan uppstå.