Cnidosac i Cladobranchia
Comparative anatomy of the cnidosac
För denna studie har många antaganden gjorts om cnidosac morfologins enhetlighet bland cladobrancher som hyser kleptocnider. Särskilt Edmunds tillhandahåller teckningar som är anmärkningsvärt konsekventa mellan arter av Fionidae, Favorinidae, Facelinidae och Aeolidiidae, även om beskrivningar av cnidosac inte var det primära syftet med den publikationen. Alla arter som illustreras i det arbetet har en tydlig ingång som förbinder matsmältningskörteln med cnidosac (även om det i vissa fall visas en lätt förlängning av ingången, som liknar en kanal) och en tydlig utgång vid ceras spets som förbinder cnidosac med utsidan. Dessutom avbildas alla cnidosacs med kleptocnider, och sättet som muskulaturen presenteras på är också mycket enhetligt. Den mest detaljerade studien om aeolidernas cnidosacs, hittills, skrevs av Kälker och Schmekel , men den beskrev inte tillräckligt den variation som kan hittas i denna struktur över de cirka 600 arterna av aeolider . Dessutom började arbetet med de cnidosac-liknande strukturerna hos Hancockia spp. först nyligen .
I denna studie finner vi att längden, storleken och strukturen på ingången till cnidosac varierar mer än vad som förväntades baserat på tidigare arbete, liksom strukturen på utgången, eller cnidoporen, muskulaturen som omger cnidosacen samt kleptocnidernas position och orientering . Det är viktigt att notera att även om vi ger ett brett taxonprov av morfologiska karaktärer för cnidosac, fanns det för många arter endast ett exemplar tillgängligt för analys. Observationerna om avsaknad i vissa fall bör därför tas med försiktighet. Vi diskuterar dessa taxa särskilt nedan.
I tidigare arbeten presenteras endast en kort och enkel ingång till cnidosac (dvs. en direkt öppning) , vilket sannolikt beror på urvalet av taxa som har detta tillstånd helt enkelt av en slump. Vårt arbete tyder på att detta är den vanligaste övergången mellan matsmältningskörteln och cnidosac. Hancock och Embleton nämner dock förekomsten av en cilierad kanal hos Aeolidia (= Eolis) papillosa och Herdman och Clubb noterar förekomsten av en ”lång, böjd förbindelsekanal” hos det som nu är Facelina bostoniensis (= Facelina drummondi). Några få taxa har en cilierad kanal, bland annat Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina och Paraflabellina ischitana . Dessa taxa är inte nära besläktade, och därför är kanalen inte homolog bland de taxa som har den, vilket tyder på en funktionell förklaring till dess närvaro. Vi misstänkte inledningsvis att förekomsten av denna långsträckta kanal var relaterad till kleptocnidernas storlek, eftersom A. papillosa, C. amboinensis och P. ianthina alla avskiljer större kleptocnider (> 20 μm i längd). Detta stöds dock inte av C. peregrina och P. ischitana, eftersom dessa arter avskiljer mindre nematocystor. I dessa fall kan den cilierade kanalen vara en relikt av ett föråldrat byte av diet, men den eventuella funktionella betydelsen av den cilierade kanalen förblir spekulativ.
På samma sätt finns det inget enhetligt mönster bland de taxa som har en proliferationszon jämfört med de som inte har det. Det enda undantaget är frånvaron av en proliferationszon hos taxa som inte avskiljer nematocystor från släktet Phyllodesmium. Den enda art inom Phyllodesmium där vi identifierade en proliferationszon är P. jakobsenae, som är den enda art av Phyllodesmium som är känd för att hysa kleptocnider. Det är fortfarande oklart varför vissa taxa verkar ha en proliferationszon medan andra inte har det, men vi misstänker att i ett litet antal fall har artefakter vid sektionering av vissa prover lett till att denna region förstörts (troligen på grund av svårigheter att bevara), vilket leder till membranfragment och fritt flytande kleptocnider i cnidosackerna hos vissa arter a (t.ex. Cratena peregrina; fig. 4d). För att ta reda på detta bör fler individer från dessa arter undersökas. Den uppenbara avsaknaden av en proliferationszon kan också bero på skillnader i tillväxtstadiet hos de undersökta individerna, eller hos ceratorna om några var i regenerationsprocessen, men vi fann inga bevis som uttryckligen stöder någon av dessa hypoteser. Vidare nämnde åtminstone en tidigare studie förekomsten av denna region , men den diskuterades inte i detalj. Det är i denna region som nematocystorna tas upp av cnidofagerna innan de vandrar mot den distala änden av cnidosakan. Den exakta omfattningen av proliferationszonen är dock fortfarande oklar. Hos vissa arter verkar den vara begränsad till cnidosac (t.ex. Pteraeolidia ianthina; fig. 4a), men hos andra arter verkar denna zon sträcka sig in i de intilliggande delarna av digestionskörteln (t.ex. Dondice occidentalis; fig. 4b). Hos majoriteten av de taxa som avskiljer nematocystor fann vi endast mycket enkla utgångar från cnidosac, som i vissa fall är täckt av ett tunt epitel. Detta täcke innehåller celler som liknar cellerna i ceratas epidermis, som består av långsträckta kolonnceller med vad som verkar vara många specialiserade vakuoler. Enkla utgångar är de vanligaste, både i vår studie och till synes i andra . Hos några få utvalda taxa inom Aeolidiidae, däribland Aeolidia papillosa, Anteaeolidiella chromosoma och Cerberilla amboinensis, finns dock en komplex cnidopor (Fig. 4c). Den bär ett epitelfoder som verkar vara kontinuerligt med epidermis. Denna struktur har identifierats tidigare , men betraktades helt enkelt som en zon av odifferentierade celler som troddes fungera som en reserv för förlorade cnidofager. På grund av placeringen vid den distala änden av cnidosac, och som en del av cnidoporen, misstänker vi dock att så inte är fallet. Istället antar vi att detta cellskikt är en speciell anpassning för att frigöra de exceptionellt långa och smala nematocystor som är avsatta från anemoner (upp till 50-60 μm i längd, men < 5 μm i bredd). Termen cnidopor har tidigare använts okritiskt för att hänvisa till alla utgångar från cnidosac , men vi omdefinierar nu termen cnidopor här för att hänvisa till den struktur som hittills bara funnits hos Aeolidiidae.
Och även om muskulaturen som omger cnidosac också varierar mellan Aeolidida, är betydelsen av denna variation oklar. Muskulaturen runt cnidosac är mycket tunn eller saknas helt hos endast ett fåtal arter, däribland Embletonia gracilis, Embletonia pulchra och Bulbaeolidia alba. När den finns varierar muskeltjockleken mellan arterna, från vad som verkar vara ett till flera lager. Denna variation i muskulaturens tjocklek illustreras i en tidigare studie , dock inte så exakt som vi anger här (tabell 3). Det finns ingen uppenbar evolutionär förklaring till variationen i muskeltjocklek eller antalet muskelskikt mellan olika taxa , men ett tjockare muskelskikt skulle sannolikt resultera i en kraftigare utstötning av kleptocniderna. Ökad muskulatur kan vara förknippad med predationstryck, storleken på de införlivade kleptocniderna eller utvecklingsstadiet. Inkorporering av ytterligare individer från varje art och i olika utvecklingsstadier samt mätningar av kleptocnidernas storlek och muskeltjocklek skulle vara fördelaktigt för att bedöma dessa hypoteser.
Differentieringen av cnidofager från en funktionell, aktiv cell till en ”behållare eller ett förråd” av kleptocnider vid cnidosackens spets återspeglar mognaden av kleptocniderna via protontransport, som är omogna och icke-funktionella när de först avskiljs . Efter mognad verkar cellerna inte längre ha någon funktion på grund av minskad cellkomplexitet. Tidigare arbetare har försökt ta itu med ursprunget till cnidofagens membran , och har nyligen dragit slutsatsen att det är en fagosom, en specialiserad vesikel som bildas av cellmembranet . Inom cnidofager kan antalet kleptocnider variera både inom och mellan taxa. Detta verkar vara förknippat med kleptocnidernas storlek; det tenderar att finnas färre stora kleptocnider (> 20 μm långa) inom en viss cnidofag jämfört med de med mindre kleptocnider (vanligtvis 10 μm eller mindre). Ett exempel finns hos Pteraeolidia ianthina (Fig. 4a), som avskiljer nematocystor i flera storleksklasser.
Avvikelser från det allmänna temat
De morfologiska karaktärer som bedömts i den här studien tycks vara ganska varierande inom familjerna, men de flesta cnidofagerna varierar generellt sett på ett tema som är bevarat i hela Aeolidida. Det finns dock fortfarande andra som har förlorat särskilda cnidosacstrukturer eller som har förlorat cnidosac helt och hållet. Man kan anta att cnidosacerna förlorar kopplingen till matsmältningskörteln eller muskulaturen som omger cnidosacerna när inga nematocystor är avsatta. Till exempel har arter från släktet Phyllodesmium (utom P. jakobsenae) muskelbundna cnidosacs som verkar sakna kleptocnider, men det finns inga uppenbara ingångar till matsmältningsdivertikeln eller utgångar till den yttre miljön. Dessa arter binder snarare kemikalier för försvar och behöver därför inte nödvändigtvis en strukturerad ingång. På detta sätt kan cnidosakerna i Phyllodesmium likna mantelns dermala formationer hos Charcotiidae, som saknar en utgång men släpper ut innehållet när de komprimeras . Hos arter från släktet Favorinus är dock cnidosacens övergripande struktur (inklusive öppningen från matsmältningskörteln och musklerna runt cnidosacen) densamma, men inga kleptocnider finns på grund av att dessa arter har en förkärlek för att äta ägg från andra snäckor och sniglar . Även om det är möjligt att bristen på kleptocnider kan bero på en hypotetisk benägenhet hos Phyllodesmium och Favorinus att släppa ut nematocystor under fixeringsprocessen, menar vi att detta är osannolikt. För det första verkar medlemmar av Phyllodesmium ha ett intakt epitel där man skulle ha kunnat förvänta sig att kleptocniderna skulle skjutas ut. Om kleptocniderna skulle kastas ut under fixeringen skulle cerorna fixeras med en öppning i spetsen. Dessutom är frånvaron av kleptocnider i särskilt Phyllodesmium också väldokumenterad (med undantag för P. jakobsenae) . Hos Favorinus är det möjligt att så är fallet, med tanke på det öppna epitelet vid ceratornas spets (t.ex. Fig. 2c), men frånvaron av kleptocnider stämmer överens med att medlemmarna i detta släkte har för vana att äta snäckors ägg.
Ännu fler variationer på detta tema finns hos Bulbaeolidia alba, Embletonia spp. och arter inom släktet Fiona. Bulbaeolidia alba har en säck i den distala änden av matsmältningskörteln som endast innehåller enstaka zooxantheller (Symbiodinium). Dessutom kunde vi inte hitta någon uppenbar ingång eller utgång till eller från säcken, och strukturen verkar vara omgiven av några tunna muskelfibrer. Vi antog att avsaknaden av kleptocnider kan bero på den mycket lilla storleken hos B. alba, som därför kanske besitter ett lägre försvarsbehov, men även mindre taxa inom släktena Embletonia och Pseudovermis besitter kleptocnider. Alternativt antar vi att bristen på sekretion kan vara relaterad till storleken eller användbarheten av de nematocystor som finns i de anemoner som denna art livnär sig på . Ett tredje alternativ är att B. alba i stället rymmer andra naturliga föreningar i denna säck, antingen från sitt byte som i Phyllodesmium eller producerade de novo. Återigen är det möjligt att avsaknaden av kleptocnider i B. alba är en artefakt på grund av den lilla provstorleken, men i likhet med Phyllodesmium kunde inga tecken på extrudering hittas. Medlemmar av Embletoniidae verkar ha evolutionärt förlorat muskulaturen som omger cnidosac helt och hållet eller representerar ett mellansteg i cnidosacs evolution, vilket diskuteras i avsnittet om cnidosacs evolution nedan. Det finns inte heller någon uppenbar ingång eller utgång till och från cnidosac hos dessa taxa. Slutligen har vissa arter av Fionidae inom släktet Fiona (denna studie) förlorat cnidosacerna helt och hållet, förmodligen på grund av att arterna i detta släkte föredrar icke-nidariska byten .
Sequestrerade nematocystor har också hittats i en annan familj inom Cladobranchia, Hancockiidae. Vi ser strukturer hos Hancockia californica som är mycket lika cnidosacs (som vi kallar cnidosac-liknande), med kleptocnider inrymda i cnidofagliknande celler i flera muskelsäckar vid spetsen av varje ceras. Dessa strukturer har också hittats hos Hancockia uncinata och H. schoeferti , och i vissa fall har cnidosac-liknande strukturer hittats i både cerata och rhinophoralskidor. Homologiska slutsatser om de strukturer som finns hos Hancockiidae och de som finns hos Aeolidida diskuteras i nästa avsnitt.
Fylogeni hos Cladobranchia och utvecklingen av cnidosac
Fylogenetiska slutsatser
Med tanke på att en stor del av de molekylära data som ingår här härstammar från tidigare publicerade studier, stämmer den topologi som härleds i vår fylogenetiska analys (figur 5) överens med den som hittas i de båda nyligen genomförda fylogenomiska studierna . Detta arbete utvidgar dock tidigare resultat genom att inkludera taxa som inte analyserats i de senaste fylogenomiska studierna, nämligen taxa från släktena Phyllodesmium, Caloria, Pruvotfolia, Pteraeolidia, Cratena, Facelina, Glaucus, Calmella, Piseinotecus, Tergipes, Notaeolidia, Embletonia och Charcotia. Majoriteten av dessa faller inom de klasser som vi kan förvänta oss baserat på tidigare molekylärt arbete: Phyllodesmium är nära besläktad med Dondice inom facelinidkladen som är syster till Aeolidiidae ; Caloria stöds inom den andra facelinidkladen och är nära besläktad med arter av Pruvotfolia ; Facelina, Glaucus och Cratena är nära besläktade inom den andra facelinidkladen ; Calmella är nära besläktad med Flabellina och Paraflabellina ; och Tergipes faller inom det som nu är Fionidae . Placeringen av Pteraeolidia som nära besläktad med Palisa och Austraeolis inom den andra facelinidkladen är dock ny för den här studien, och de molekylära data som presenteras här stödjer placeringen av Charcotia inom systergruppen till Aeolidida, vilket tidigare föreslagits genom morfologiskt arbete .
Trots tillägget av alla de nya data som presenteras här förblir positionerna för Notaeolidia och Embletonia oklara . Stödet för de exakta positionerna för dessa två släkten är svagt, och dessa taxa verkar bidra till de låga bootstrap-värdena vid basen av Aeolidida. Detta kan bero på att Notaeolidia och Flabellinopsis iodinea och Embletonia och Unidentia drar till sig långa grenar. Morfologiska analyser stöder dock också åtminstone en tidigare divergens av Notaeolidia inom Aeolidida . Osäkerheten kring släktskapen mellan dessa fyra taxa har konsekvenser för vår förståelse av cnidosackens evolution.
Vi finner också att de enskilda genernas trädanalyser (och analysen av tre gener) överensstämmer med tidigare storskaliga PCR-baserade sekvensanalyser . Dessa topologier och posteriora sannolikheter stöder idén att PCR-baserade sekvenseringsdata för de gener som använts (COI, 16S och 18S) ger viss nytta för att härleda nyligen inträffade divergenser, men att sekvenseringsdata med hög genomströmning är nödvändiga för att härleda djupare divergenser.
Cnidosac evolution
Sekvensering av nematocystor hos nässeldjur har uppkommit minst två gånger inom Cladobranchia baserat på den fylogeni som presenteras här (fig. 6). Detta resultat indikerar också att arter inom Aeolidida som inte sekonderar nematocystor har förlorat denna förmåga, vilket verkar ha inträffat minst tre gånger. Dessutom är den tidiga divergensen av Embletoniidae inom den aeolida fylogenin suggestiv; den indikerar att strukturen inom Embletoniidae är en cnidosac, och att avsaknaden av muskulatur runt cnidosac kan representera ett mellansteg i evolutionen av kleptocnidsekvestrering. Det krävs dock starkare stöd för släktskap vid basen av Aeolidida innan ytterligare slutsatser kan göras. Våra resultat stöder också flera oberoende förluster av cnidosacen, bland annat hos medlemmar av Fiona och Tergipes. Detta verkar bero på att Fiona övergått till att främst äta kräftdjur som bytesdjur. En övergång från hydroider till andra typer av organismer kan också ha lett till förlusten av cnidosacs hos vissa arter av Tergipes .
Närvaron av en säck i den distala änden av matsmältningskörteln antas ha uppstått före förmågan att binda nematocystor (figur 6; grå ruta), även om detta resultat bygger på hypotesen att de terminala säckar som finns hos Charcotiidae och Proctonotidae är homologa till dem hos Aeolidida. Stödet för denna hypotes är mycket lågt och verkar därför osannolikt baserat på vår rekonstruktion. De terminala säckarna hos Charcotiidae och Proctonotidae anses dock fungera som utsöndringsstrukturer, och vissa har antagit att aeolididas cnidosac är en anpassning av denna säck för försvar . Även om homologin förblir osäker förkastar vår rekonstruktion av förfädernas tillstånd inte helt och hållet denna modifieringshypotes, där den distala säcken anpassades för att fånga upp nematocystor. Fler morfologiska och molekylära data från ytterligare arter i kladen Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidae är nödvändiga för att ytterligare testa denna hypotes, eftersom denna klad inte är välrepresenterad i vår analys, vilket kan försvåra evolutionära slutsatser.
De cnidosac-liknande strukturerna i Hancockiidae verkar ha utvecklats oberoende av den distala säcken i både Aeolidida och dess systerklad. Detta stöds av de fylogenetiska analyser som presenteras här samt av skillnader i sekvenseringsprocessen mellan Hancockia och arter av aeolider. Det verkar till exempel som om Hancockia-arter kapslar in nematocystor i lumen i matsmältningskanalen före transport , till skillnad från aeolider.