Observation av befruktade embryon till klyvningsembryon
Sedan den första kaninembryokulturen beskrevs 1912 och muszygoten kunde odlas in vitro för att bilda embryon i blastocyststadiet , har embryokvaliteten blivit en viktig faktor för graviditet efter överföringen av in vitro-embryon till livmodern, eftersom embryokvaliteten har ett nära samband med överförda embryons implantation i livmodern. Sedan det första provrörsbarnet, Louise Brown, föddes i juli 1978, för vilket Nobelpriset i fysiologi eller medicin 2010 tilldelades Robert Edwards för att ha utvecklat in vitro-fertilisering (IVF) och embryoöverföring (ET) för att behandla infertilitet hos kvinnor med ovidukter som inte är patenterade, har in vitro-embryoproduktion använts i stor utsträckning vid behandling av infertilitet hos människor och vid reproduktion och expansion av djurpopulationer. Framgången för den assisterade reproduktionstekniken beror dock främst på produktionen av livskraftiga embryon med hög implantationspotential. Ännu viktigare är att välja det bästa embryot för överföring, vilket har blivit den största utmaningen inom IVF. I den tidiga embryokulturen baserades bedömningen av embryokvaliteten huvudsakligen på morfologiska kriterier för det överförda embryot. Att utföra en serieobservation av embryots morfologi är därför en vanlig teknik för embryologer för att utvärdera embryon och har betraktats som en viktig prediktor för implantation och graviditet . Under lång tid har embryologer utfört bedömningar av embryots kvalitet och morfologi genom att ta ut embryona ur inkubatorn och placera dem i mikroskop. Förutom morfologiska observationer är forskarna intresserade av en rad studier om cellkärnförändringar, genaktivering och genuttryck, cytoplasmatiskt proteinuttryck, blastomerdifferentiering och så vidare. Dessa studier leder dock ofta till att embryon dör. Till exempel, i vår tidiga studie som observerade mikrospindelförändring efter spermiernas inträde i ägget eller aktivering av oocyten, behövde de befruktade zygotterna eller aktiverade äggen fixeras på objektglaset och färgas med immunocytokemiskt fluorescein och laserkonfokal mikroskopi . Vår forskning visade tydligt att mikrotubuli och kromatin förändrades efter aktivering av oocyter från nötkreatur och introcytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI; figur 1). Spermierna i oocyten eller kalciumjonoforen och etanol kan aktivera oocyten och orsaka extrusion av den andra polkroppen. För att observera tidpunkten för den andra polkroppen färgade vi olika stadier av oocyter efter aktivering. Resultatet visade att efter 5 timmars postaktivering kan den andra polkroppen vara helt extruderad (figur 2).
Figur 1.
Laser-scanning konfokalmikroskopi av spindel- och kromatinförändringar vid olika tidpunkter efter aktivering och intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) hos nötkreatur. Stora bokstäver (vänster) anger förändringen efter aktivering och små bokstäver (höger) anger efter ICSI. A/a visade vid 0,5 h, B/b är 2 h, C/c är 3 h och D/d är 7 h efter aktivering eller ICSI. Prenukleus i aktiverat ägg och prenukleus i ICSI-ägg har synts med röd färg.
Figur 2.
Laser-scanning konfokalmikroskopi av spindel- och kromatinförändringar vid olika tidpunkter efter aktivering hos nötkreatur. Vid 0,5 timmar efter aktivering börjar kromosomerna i spindeln att dela sig. Spindelns delning är avslutad efter cirka 3 timmar och den andra polkroppen kan utvinnas efter cirka 5 timmar. Det röda och gröna tillsammans anger spindeln, och den röda punkten anger den första polkroppen.
Studier av genuttryck kräver ofta att man isolerar mRNA eller protein från embryon ; därför behövde embryon lyseras och inget embryo skulle överleva. För att studera celldifferentieringen hos embryon i mor- och blastocyststadiet har en dubbel färgning med fluoresceinmikroskopimetod använts för att skilja inre cellmassa (ICM) från trophoektoderm (TE). Antalet två olika celler kan räknas utifrån olika färger (ICM som blå och TE som rosa, figur 3).
Figur 3.
Distinktion av olika celler i blastocystembryon från nötkreatur med dubbel färgning. Översta figuren visar ett blastocystembryo med markerad inre cellmassa (ICM) och runtomkring trophektodermceller (TE). Den nedre figuren visar ett blastocystembryo från nötkreatur med dubbelfärgning med blått som ICM och rosa som TE-celler. Bilden överst kommer från sökning på en webbsida, och författaren uppskattar mycket Prof. Fuliang Du’s artighet för den opublicerade nedre bilden.
Dessa forskningsmetoder skadar i slutändan alla embryon, och det är omöjligt att tillämpa dessa metoder i klinisk praxis. Därför baseras den nuvarande bedömningen av embryokvaliteten främst på morfologiska kriterier för överförda embryon, som omfattar tre huvudparametrar såsom blastomerernas regelbundenhet, fragmentering och cytoplasmatisk granularitet . Även antalet embryoceller på olika odlingsdagar och flerkärnighet kan beaktas för att utvärdera embryokvaliteten. Flera rapporter har dokumenterat sambandet mellan morfologiska egenskaper hos embryon i klyvningsstadiet och graviditetsframgång. Detta är därför för närvarande den grundläggande metoden för bedömning av embryokvalitet vid IVF på människor och vid in vitro-produktion av embryon på djur. Även om denna metod är lätt att tillämpa, tas embryon ofta ut ur inkubatorn, vilket leder till oro för odlingsförhållandenas säkerhet och stabilitet. Dessutom kan vissa viktiga punkter i embryoutvecklingen missas under observationen. Utvärdering av klyvningsembryon under odling och före embryoöverföring är en viktig klinisk praxis. För närvarande är den viktigaste bedömningen av in vitro-befruktade embryon visuell observation med hjälp av mikroskopi. Under de senaste åren har olika inkubatorer med tidsfördröjningsmikroskopi använts på kliniker för mänsklig IVF för att övervaka alla steg i embryots tillväxt och utveckling. Även om PGD/PGS-teknik (preimplantationsdiagnostik och screening av embryon) har tillämpats vid urval av mänskliga embryon för att förbättra graviditetsfrekvensen, är dessa tekniker invasiva för embryona. Att hitta en annan icke-invasiv metod för att välja ut ett bra embryo kommer att vara till stor nytta för ART-metoder för människor. Sallam et al. har granskat icke-invasiva metoder för urval av embryon och utvärderat dessa metoder mot bakgrund av de bästa tillgängliga bevisen för att ta reda på om någon av dem är mogen för att ersätta eller komplettera den gamla hederliga metoden med morfologisk bedömning. Vi behöver alltså kraftfullare verktyg för att uppskatta embryons morfokinetiska markörer.
2.1. Morfokinetik för embryoklyvning baserad på tidsförloppsbilder
I årtionden har forskare försökt följa utvecklingen av flercelliga organismer från befruktade ägg till vuxna organismer. Även om forskarna hade utforskat enskilda steg i denna process fanns det ingen metod som gjorde det möjligt för dem att modellera hela utvecklingsprocessen live. För närvarande har framsteg inom ljusplåtmikroskopi som rapporterats i två Nature Methodspapers gjort det möjligt för forskare att visualisera tidig utveckling i stor detalj . I de senaste ljusmikroskopen används ett ark av laserljus för att belysa ett tunt snitt av ett prov och fånga hela planet i en enda ögonblicksbild. Detta gör att de kan använda mycket mindre ljus än konfokala eller tvåfotonmikroskop. Det är mycket snabbt men också mycket skonsamt att prestera extremt bra på flera kritiska sätt samtidigt . För att avbilda utvecklingen av hela embryon som de hos Drosophila, zebrafiskar och möss är denna nya bildteknik med flera vyer fantastisk.
Time-lapse imaging är en annan icke-invasiv, framväxande teknik som gör det möjligt att övervaka embryoutvecklingen dygnet runt, vilket ger möjlighet till ökad kvantitet och kvalitet av morfologisk information utan att störa odlingsförhållandena . Time-lapse-mikroskopet är mycket användbart för observation av embryoutveckling. Under det senaste decenniet har många IVF-kliniker eller centra för mänsklig befruktning börjat använda tidsförloppsbilder för att övervaka embryots tillväxt och delning under in vitro-odling och slutligen för att välja ut embryon av god kvalitet för överföring enligt registrerade data och bilder. Det har rapporterats att denna teknik kan förbättra embryoimplantationen och graviditeten. På grundval av tidsupptagningar av embryots klyvning kan den normala klyvningshastigheten för embryot bestämmas. I det andra kapitlet i den här boken beskrivs därför tidpunkten för embryoklyvning utifrån morfokinetiska markörer med hjälp av time-lapse monitorn. Med hjälp av denna tidtabell för embryoklyvning kan embryologer tydligt veta i vilket stadium ett embryo bör befinna sig vid olika tidpunkter. På så sätt kan ett embryo av optimal kvalitet eller ett embryo med hög potential för implantation väljas ut för överföring för att uppnå en högre graviditetsfrekvens. Med hjälp av ett system för kontinuerlig och frekvent registrering av tidsförlopp kan vissa morfokinetiska markörer avslöjas i tidsförloppssystemet. Till exempel leder en snabb delning av embryocellerna vid en viss tidpunkt ofta till en lägre implantationsfrekvens. I en normal situation kräver delningen från zygot till 2-3 celler cirka 10-11 timmar, men Rubio et al. fann att vissa embryon bara behöver cirka 5 timmar för att slutföra denna delning, och dessa embryon har en mycket lägre implantationsfrekvens än embryon med normal delning (1,2 % jämfört med 20 %). Också embryonens ojämna klyvning, som definieras som en uppdelning av en blastomerer i tre dotterblastomerer eller ett intervall i cellcykeln som är kortare än 5 timmar, ger ofta en betydligt lägre implantationspotential. Vi kan alltså använda dessa mer exakta morfokinetiska markörer för att särskilja embryokvaliteten.
I det tredje kapitlet undersöks och verifieras ytterligare om tidsförloppsbildteknik är användbar för att välja ut embryon av ”högsta kvalitet” för överföring för att förbättra ART-resultatet i stället för konventionell morfologisk utvärdering. Intressant nog har de möjliga korrelationerna mellan embryots kön, embryofragmentering, behandlingsprotokoll, olika odlingsmedier och embryots morfokinetik utvärderats på grundval av några nya undersökningar om anläggningar för tidsuppskattningsbilder. Dessutom diskuteras olika algoritmer och prediktiva modeller som utformats i ART-cykler med tidsuppföljningsbilder. Många undersökningar av djurens och människans embryonala utvecklingshastighet genom vanlig morfologisk observation visade till exempel att manliga embryon växer snabbare än kvinnliga embryon . Den nuvarande tidsstegsobservationen kan dock ge mer detaljerad och exakt information om skillnaden mellan manliga och kvinnliga embryon under tidiga delningar. Även om kvinnliga embryon uppvisade sena morfokinetiska parametrar i klyvningsstadiet (t8), morulastadiet (tM) och blastocyststadiet, uppvisade de en tidigare expansion än manliga embryon. Således är de viktigaste tidpunkterna för observation relaterade till embryots könsutveckling. Intressant nog utformade författarna en modell enligt tiden för andra synkronisering och morulabildning med fyra undergrupper för att förutsäga sannolikheten för att ett embryo är kvinnligt.
För att ytterligare studera och utforska morfokinetiken för embryoklyvning diskuteras i det fjärde kapitlet några metoder för spatiotemporal analys av embryoklyvning in vitro.Automatiserad eller halvautomatiserad time-lapse-analys av bilder av tidiga embryon under klyvningsstadiet kan ge en inblick i mitosens tidpunkt, regelbundenhet i både delningstidpunkt och delningsmönster samt i cellinjen. Samtidig övervakning av molekylära processer gör det möjligt att studera sambanden mellan genetiskt uttryck och cellfysiologi och utveckling. Med hjälp av tidsförloppsbildningsdata och analytisk programvara kan man enkelt skapa en fyrdimensionell videosekvensering av embryon, så att växande embryon visar nya insikter i den tidsmässiga embryoutvecklingen. I det här kapitlet beskriver författarna tre metoder med variationer i hårdvara och mjukvaruanalys genom att ge några exempel på resultaten för att öppna ett fönster till ny information inom utvecklingsembryologin, eftersom embryodelningsmönster och könslinjer studeras in vivo.
2.2. Genuttryck hos klyvningsembryon och icke-invasiv bedömning av embryots livskraft via analys av kulturmedier
Preimplantationsembryots utveckling genomgår en rad kritiska händelser och anmärkningsvärda epigenetiska modifieringar, och en omprogrammering av genuttrycket sker för att aktivera det embryonala genomet. I de tidiga stadierna av preimplantationsembryots utveckling styr mRNA från moderns sida embryoutvecklingen. Under hela den tidiga embryonalutvecklingen bibehålls ett differentiellt metyleringsmönster, även om vissa uppvisar stadiespecifika förändringar. Nya studier har visat att en differentiell demetyleringsprocess resulterar i ett differentiellt föräldragenuttryck i de tidigt utvecklade embryona, vilket kan ha en inverkan på den korrekta utvecklingen. Dessutom har icke-kodande RNA, långa icke-kodande RNA (lncRNA) och korta icke-kodande RNA, mikroRNA (miRNA) visat sig spela en viktig roll i regleringen av mRNA, och därför har deras roll i preimplantationsutvecklingen fått ökad betydelse. I kapitel fem granskas de olika faktorer som påverkar genuttrycket under utvecklingen av preimplantatembryon, vilket inkluderar epigenetiska faktorer, med fokus på metyleringsprofiler, i könsceller och preimplantatembryon. Effekterna av icke-kodande RNA på genuttryck utvärderades grundligt.
Då genuttrycket framträder under embryoutveckling i in vitro-kultur, kräver preimplantationsembryon ofta kulturmedier med riklig näring. Embryot under sin tillväxt och utveckling behöver absorbera vissa viktiga näringskomponenter från kulturmediet och metaboliskt producera vissa biprodukter som genuttrycksresultat. Ur denna synvinkel ger in vitro-odling av embryon också ett mycket viktigt material för ytterligare icke-invasiv utvärdering av embryon genom att undersöka biomarkörer i det förbrukade embryokulturmediet. De metoder som för närvarande utvecklas är inriktade på mätning av metaboliska föreningar som utsöndras från embryon under utveckling. I dessa studier används främst verktyg för modern analytik och proteomik. Vissa studier tyder på att metabolisk profilering av embryokulturmedier med hjälp av optiska och icke-optiska spektroskopier kan utgöra ett användbart komplement till de nuvarande strategierna för bedömning av embryon och ge insikt i fenotypen hos embryon med ökande reproduktionspotential .
I det sjätte kapitlet beskriver författarna sin nya upptäckt, alfa-1-kedjan i den humana haptoglobinmolekylen som en kvantitativ biomarkör för embryots livskraft. I en serie retrospektiva, blinda experiment uppnåddes mer än 50 procents framgång. I det här kapitlet sammanfattas de metaboliska och proteomiska metoder som för närvarande finns tillgängliga för icke-invasiv molekylär bedömning av embryots livsduglighet. Nya studier har visat att bedömningen av de molekylära komponenterna i näringsmedier är ett lovande område när det gäller att söka efter markörer för framgångsrik embryoimplantering med efterföljande utveckling av en klinisk graviditet och födelse av ett friskt barn för att effektivisera behandlingen med hjälp av ART-tekniker . Om den molekylära sammansättningen av odlingsmedier kan användas som ett ytterligare icke-invasivt förfarande för att välja ett embryo för selektiv överföring, kommer det att vara mycket användbart för att förbättra utfallet av IVF-graviditeter hos människor.