Fluorescens

Fluorescens är en luminescens som oftast förekommer som ett optiskt fenomen i kalla kroppar, där den molekylära absorptionen av en foton med en viss våglängd utlöser emissionen av en annan foton med en längre våglängd. Ämnet som fluorescerar kallas för en fluorofor. Energidifferensen mellan de absorberade och emitterade fotonerna slutar som molekylära vibrationer eller värme. Vanligtvis ligger den absorberade fotonen i det ultravioletta området och det emitterade ljuset i det synliga området, men detta beror på vilken fluorofor som används och andra faktorer.

Fluorescens har fått sitt namn efter mineralet fluorit, som består av kalciumfluorid, som ofta uppvisar detta fenomen. En mängd andra mineraler och organiska material fluorescerar också, och de används för ett antal olika tillämpningar. Fluorescens är till exempel användbart för att belysa och märka molekyler i analytisk kemi och biokemi. Fluorofoner har använts för att märka celler, antikroppar och andra biologiska strukturer och för att bestämma deras strukturer och verkningsmekanismer.

Exempel på fluorescerande material

Emstenar, mineraler, fibrer och många andra material som kan påträffas i kriminaltekniska undersökningar eller i samband med olika samlarföremål kan ha en distinkt fluorescens eller kan fluorescera på olika sätt under kortvågigt ultraviolett, långvågigt ultraviolett eller röntgenstrålar.

Många typer av kalcit och bärnsten fluorescerar under kortvågigt UV. Rubiner, smaragder och Hope-diamanten uppvisar röd fluorescens under kortvågigt UV-ljus; diamanter avger också ljus under röntgenstrålning.

Råolja (petroleum) fluorescerar i en rad olika färger, från tråkigt brunt för tunga oljor och tjära till ljust gulaktigt och blåvitt för mycket lätta oljor och kondensat. Detta fenomen används vid oljeprospekteringsborrningar för att identifiera mycket små mängder olja i borrspån och kärnprover.

Organiska vätskor, t.ex. blandningar av antracen i bensen eller toluen, eller stilben i samma lösningsmedel, fluorescerar vid bestrålning med ultraviolett- eller gammastrålning. Avklingningstiderna för denna fluorescens är i storleksordningen nanosekunder eftersom ljusets varaktighet beror på livslängden för de exciterade tillstånden hos det fluorescerande materialet, i detta fall antracen eller stilben.

Användningar

Det finns många naturliga och syntetiska föreningar som uppvisar fluorescens, och de har ett antal tillämpningar. Vissa djuphavsdjur, t.ex. grönögat, använder sig av fluorescens.

Belysning

Det vanliga lysröret förlitar sig på fluorescens. Inne i glasröret finns ett delvis vakuum och en liten mängd kvicksilver. En elektrisk urladdning i röret får kvicksilveratomerna att avge ljus. Det utsända ljuset ligger i det ultravioletta (UV) området, är osynligt och är skadligt för de flesta levande organismer. Röret är försett med en beläggning av ett fluorescerande material, kallat fosfor, som absorberar det ultravioletta ljuset och återutsänder synligt ljus. Lysrörsbelysning är mycket energieffektiv jämfört med glödlampsteknik, men de spektrum som produceras kan få vissa färger att framstå som onaturliga.

I mitten av 1990-talet blev vita lysdioder (LED) tillgängliga, som fungerar genom en liknande process. Typiskt sett producerar själva den ljusemitterande halvledaren ljus i den blå delen av spektrumet, som träffar en fosforförening som deponerats på chipet; fosforen fluorescerar från den gröna till röda delen av spektrumet. Kombinationen av det blå ljuset som passerar genom fosforn och det ljus som avges av fosforn ger ett nettoutsläpp av vitt ljus.

Den moderna gatubelysningen med kvicksilverånga sägs ha utvecklats från lysrörslampan.

Glödlampor oxiderar fenyloxalatester för att producera ljus.

Kompakt lysrörsbelysning (CFL) är densamma som vilken vanlig lysrörslampa som helst med fördelar. Den är självförstärkt och används för att ersätta glödlampor i de flesta tillämpningar. De producerar en fjärdedel av värmen per lumen som glödlampor och håller ungefär fem gånger så länge. Dessa glödlampor innehåller kvicksilver och måste hanteras och kasseras med försiktighet.

Analytisk kemi

Fluorescens i flera våglängder kan detekteras av en array-detektor, för att detektera föreningar från HPLC-flödet. Dessutom kan tunnskiktskromatografiplattor (TLC) visualiseras om föreningarna eller ett färgreagens är fluorescerande.

Fingeravtryck kan visualiseras med fluorescerande föreningar, t.ex. ninhydrin.

Biokemi och medicin

Biologiska molekyler kan märkas med en fluorescerande kemisk grupp (fluorofor) genom en enkel kemisk reaktion, och märkningens fluorescens möjliggör känslig och kvantitativ detektion av molekylen. Exempel:

• Fluorescensmikroskopi av vävnader, celler eller subcellulära strukturer åstadkoms genom att märka en antikropp med en fluorofor och låta antikroppen hitta sitt målantigen i provet. Märkning av flera antikroppar med olika fluoroforer gör det möjligt att visualisera flera mål i en enda bild.
• Automatiserad sekvensering av DNA genom kedjeavslutningsmetoden; var och en av fyra olika kedjeavslutande baser har sin egen specifika fluorescerande tagg. När de märkta DNA-molekylerna separeras exciteras den fluorescerande märkningen av en UV-källa, och identiteten på den bas som avslutar molekylen identifieras genom våglängden på det utsända ljuset.
• DNA-detektering: föreningen etidiumbromid, när den är fri att ändra sin konformation i lösning, har mycket liten fluorescens. Ethidiumbromids fluorescens förstärks kraftigt när den binder till DNA, så denna förening är mycket användbar för att visualisera DNA-fragmentens placering i agarosgelelektrofores. Ethidiumbromid kan vara giftigt; ett säkrare alternativ är färgämnet SYBR Green.
• DNA-mikroarray
• Immunologi: En antikropp har en fluorescerande kemisk grupp fäst vid sig, och de platser (t.ex. på ett mikroskopiskt prov) där antikroppen har bundits kan ses och till och med kvantifieras med hjälp av fluorescensen.
• FACS (fluorescerande aktiverad cellsortering)
• Fluorescens har använts för att studera DNA:s och proteiners struktur och konformationer med hjälp av tekniker som t.ex. fluorescensresonansenergiöverföring, som mäter avståndet på angströmsnivå. Detta är särskilt viktigt i komplex av flera biomolekyler.
• Aequorin, från maneten Aequorea victoria, ger ett blått sken i närvaro av Ca2+-joner (genom en kemisk reaktion). Det har använts för att avbilda kalciumflödet i celler i realtid. Framgången med aequorin sporrade till ytterligare undersökningar av A. victoria och ledde till upptäckten av grönt fluorescerande protein (GFP), som har blivit ett extremt viktigt forskningsverktyg. GFP och besläktade proteiner används som rapportörer för ett antal biologiska händelser, inklusive sådana saker som subcellulär lokalisering. Nivåer av genuttryck mäts ibland genom att koppla en gen för GFP-produktion till en annan gen.

Också många biologiska molekyler har en inneboende fluorescens som ibland kan användas utan att man behöver fästa en kemisk tagg. Ibland förändras denna inneboende fluorescens när molekylen befinner sig i en viss miljö, så att molekylens fördelning eller bindning kan mätas. Bilirubin är till exempel starkt fluorescerande när det är bundet till en specifik plats på serumalbumin. Zinkprotoporfyrin, som bildas i röda blodkroppar under utveckling i stället för hemoglobin när järn saknas eller bly förekommer, har en ljus fluorescens och kan användas för att upptäcka dessa problem.

Sedan 2006 ökar antalet fluorescenstillämpningar inom den biomedicinska biologiska och relaterade vetenskaper. Analysmetoderna inom dessa områden växer också, om än med en alltmer olycklig nomenklatur i form av akronymer som t.ex: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. De flesta av dessa tekniker bygger på fluorescensmikroskop. Dessa mikroskop använder ljuskällor med hög intensitet, vanligen kvicksilver- eller xenonlampor, lysdioder eller lasrar, för att framkalla fluorescens i de prov som observeras. Optiska filter separerar sedan excitationsljuset från den fluorescens som sänds ut och som kan detekteras med ögat eller med en CCD-kamera eller andra ljusdetektorer (fotomultiplikatorrör, spektrografer osv.). Mycket forskning pågår för att förbättra kapaciteten hos sådana mikroskop, de fluorescerande prober som används och de tillämpningar som de används för. Särskilt intressant är de konfokala mikroskopen, som använder ett hål för att åstadkomma optisk sektionering – vilket ger en kvantitativ 3D-vy av provet.

Säkerhet

Fluorescerande glödlampor ger upphov till mycket mindre spillvärme än glödlampor och halogenlampor. Halogenlampor är inblandade i ett stort antal bränder, och glödlampor medför också en högre risk för brand än lysrörslampor, på grund av spillvärme. Lampor kan välta oavsiktligt eller ibland till följd av händelser som t.ex. jordbävningar. Att använda lysrör kan därför vara ett sätt att förebygga oavsiktliga bränder. Lysrörslampor kan dock innehålla kvicksilver, och om en sådan lampa går sönder kan det leda till ett kostsamt kvicksilverutsläpp.

Teoretiska överväganden

Fotokemi

Fluorescens uppstår när en molekyl eller en kvantprick slappnar av till grundtillståndet efter att ha blivit elektroniskt exciterad.

Excitering: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}}

Fluorescens (emission): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , här h ν {\displaystyle h\nu } är en allmän term för fotonenergi där: h = Plancks konstant och ν {\displaystyle \nu } = ljusets frekvens. (De specifika frekvenserna för exciterande och emitterat ljus är beroende av det specifika systemet.)

Stat S0 kallas fluorforens (den fluorescerande molekylens) grundtillstånd och S1 är dess första (elektroniskt) exciterade tillstånd.

En molekyl i sitt exciterade tillstånd, S1, kan slappna av genom olika konkurrerande vägar. Den kan genomgå ”icke-radiativ relaxation” där excitationsenergin avges som värme (vibrationer) till lösningsmedlet. Exciterade organiska molekyler kan också slappna av genom omvandling till ett tripletttillstånd som därefter kan slappna av via fosforescens eller genom ett sekundärt icke-radiativt relaxationssteg.

Relaxation av ett S1-tillstånd kan också ske genom växelverkan med en andra molekyl genom fluorescensdämpning. Molekylärt syre (O2) är en extremt effektiv fluorescensdämpare på grund av sitt ovanliga trippelgrundtillstånd.

Molekyler som exciteras genom ljusabsorption eller via en annan process (t.ex. som en reaktionsprodukt) kan överföra energi till en andra ”sensibiliserad” molekyl, som omvandlas till sitt exciterade tillstånd och sedan kan fluorescera. Denna process används i ljusstavar.

Fluorescenskvantutbyte

Fluorescenskvantutbytet anger fluorescensprocessens effektivitet. Det definieras som förhållandet mellan antalet emitterade fotoner och antalet absorberade fotoner.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\\\\ fotoner\ emitterade}}{\rm {\#\\ fotoner\ absorberade}}}}

Det maximala fluorescenskvantutbytet är 1,0 (100 procent); varje absorberad foton resulterar i en emitterad foton. Föreningar med ett kvantutbyte på 0,10 anses fortfarande vara ganska fluorescerande. Ett annat sätt att definiera fluorescensens kvantutbyte är genom hastigheterna för nedbrytning av exciterade tillstånd:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

där k f {\displaystyle {k}_{f}} är hastigheten för spontan emission av strålning och

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

är summan av alla hastigheter för sönderfall av exciterade tillstånd. Andra hastigheter för nedbrytning av exciterade tillstånd orsakas av andra mekanismer än fotonemission och kallas därför ofta ”icke-radiativa hastigheter”, som kan omfatta: dynamisk kollisionsdämpning, dipol-dipolinteraktion i närfältet (eller resonansenergiöverföring), intern omvandling och intersystemövergång. Om hastigheten för någon väg förändras kommer detta således att påverka både det exciterade tillståndets livslängd och fluorescenskvantutbytet.

Fluorescenskvantutbytet mäts genom jämförelse med en standard med känd kvantologi; kininsaltet, kininsulfat, i en svavelsyralösning är en vanlig fluorescensstandard.

Fluorescenslivslängd

Fluorescenslivslängden avser den genomsnittliga tiden som molekylen stannar i sitt exciterade tillstånd innan den avger en foton. Fluorescens följer vanligtvis första ordningens kinetik:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

där {\displaystyle \left} är koncentrationen av molekyler i exciterat tillstånd vid tidpunkt t {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} är den ursprungliga koncentrationen och Γ {\displaystyle \Gamma } är avklingningshastigheten eller den omvända delen av fluorescenslivslängden. Detta är ett exempel på exponentiellt sönderfall. Olika strålande och icke-strålande processer kan avfolka det exakta tillståndet. I sådana fall är den totala nedbrytningshastigheten summan av alla hastigheter:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

där Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} är den totala sönderfallshastigheten, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} den radiativa sönderfallshastigheten och Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} den icke-strålande nedbrytningshastigheten. Det liknar en kemisk reaktion av första ordningen där första ordningens hastighetskonstant är summan av alla hastigheter (en parallell kinetisk modell). Om hastigheten för spontan emission eller någon av de andra hastigheterna är snabb är livslängden kort. För vanligt förekommande fluorescerande föreningar ligger de typiska avklingningstiderna för exciterade tillstånd för fluorescerande föreningar som avger fotoner med energier från UV till nära infrarött inom intervallet 0,5 till 20 nanosekunder. Fluorescenslivslängden är en viktig parameter för praktiska tillämpningar av fluorescens, t.ex. fluorescensresonansenergiöverföring.

Regler

Det finns flera regler som handlar om fluorescens. Kasha-Vavilov-regeln dikterar att kvantutbytet av luminescens är oberoende av våglängden för exciterande strålning.

Denna regel är inte alltid giltig och överträds allvarligt i många enkla molekyler. Ett något mer tillförlitligt påstående, även om det fortfarande finns undantag, är att fluorescensspektrumet visar ett mycket litet beroende av våglängden hos den exciterande strålningen.

Se även

• Fluorescein
• Fluorescerande lampa
• Ljus
• Fosforescens
• Röntgenstrålning

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern Molecular Photochemistry. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molekylär fluorescens: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Alla länkar hämtade den 14 april 2017.

• Fluorophorer.org The database of fluorescent dyes
• Fluorescence on Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence