Fas 1 klinisk prövning av Trametes versicolor hos kvinnor med bröstcancer

Abstract

Introduktion. Oralt administrerade preparat från svampen Trametes versicolor (Tv) har antagits kunna förbättra immunsvaret hos kvinnor med bröstcancer efter standardkemoterapi och strålbehandling. Metoder. En fas I-studie med doseskalering på två centra genomfördes för att fastställa den maximalt tolererade dosen av ett Tv-preparat när det tas dagligen i delade doser i 6 veckor efter nyligen avslutad strålbehandling. Elva deltagare rekryterades och nio kvinnor slutförde studien. Varje kohort bestod av tre deltagare som fick en av tre doser Tv (3, 6 eller 9 gram). Immundata samlades in före och efter bestrålning, vid tre tidpunkter för behandling och efter en treveckors tvättperiod. Resultat. Nio biverkningar rapporterades (7 milda, 1 måttlig och 1 allvarlig), vilket tyder på att Tv tolererades väl. Immunologiska resultat visade tendenser till (1) ökat antal lymfocyter vid 6 och 9 gram/dag, (2) ökad funktionell aktivitet hos naturliga mördarceller vid 6 gram/dag, (3) dosrelaterade ökningar av CD8+ T-celler och CD19+ B-celler , men inte CD4+ T-celler eller CD16+56+ NK-celler. Slutsats. Dessa resultat visar att upp till 9 gram/dag av ett Tv-preparat är säkert och tolerabelt för kvinnor med bröstcancer efter primär behandling. Detta Tv-preparat kan förbättra immunstatusen hos immunsupprimerade bröstcancerpatienter efter standardiserad primär onkologisk behandling.

1. Introduktion

Trametes versicolor (Tv), även känd som Coriolus versicolor och vanligen kallad kalkonstjärt, är en svampart från vilken det har gjorts preparat som har en lång historia av användning i traditionell asiatisk medicin . Två proteoglykanfraktioner, polysackarid-K (PSK) och polysackaridpeptid (PSP), är liknande varmvattenextrakt från Tv med rapporterad anticanceraktivitet . I Japan förskrivs PSK rutinmässigt till cancerpatienter, både under och efter strålning och kemoterapi . Det är också vanligt att många naturläkare och integrativa onkologer i USA förskriver hel, frystorkad Tv till bröstcancerpatienter . Tv:s immunologiska aktivitet antas vara den viktigaste underliggande mekanismen som är ansvarig för dess antitumoreffekter och dess inverkan på överlevnaden . Trametes versicolors verkningsmekanism inbegriper förstärkning av både medfödda och adaptiva immunsvar, åtminstone delvis via Toll-like 2-receptor agonistisk aktivitet . Prekliniska djurstudier och preliminära kliniska data stöder hypotesen att Tv-derivat kan vara fördelaktiga vid behandling av både östrogenreceptornegativ och positiv cancer genom att mildra immunologiska depressiva effekter av behandlingen och öka den sjukdomsfria överlevnaden via förstärkning av den immunologiska övervakningen och övervinnande av tumörantigentolerans .

Förståelse av hur immunologiska faktorer påverkas av behandlingar av bröstcancer tyder på lovande områden att fokusera på när det gäller utveckling av tilläggsbehandlingar för att förstärka antitumorimmunreaktioner. Nya data visar att vissa klasser av kemoterapeutiska läkemedel orsakar immunogen tumörcellsdöd, vilket leder till en förstärkning av antigenkryspresentation och stimulering av det antitumörala immunsvaret. Det finns belägg för att NK-celler spelar en viktig roll för att förebygga både tidig och metastaserande bröstcancer . Vissa bröstcancerpatienter har rapporterats sakna NK-cellsaktivitet mot K562-målceller . Aktuella uppgifter tyder på att bröstcancerpatienter som har genomgått kirurgi, kemoterapi och strålbehandling har ett immunologiskt underskott . Andersen et al. har rapporterat att stressnivåer hos bröstcancerpatienter på ett signifikant sätt förutspådde lägre lysis av NK-celler samt minskad proliferation av perifera blodlymfocyter . Vår tidigare observationsstudie bekräftade att lymfopeni och låg NK-cellaktivitet var närvarande under de sex veckorna efter avslutad strålbehandling .

För att bättre förstå den potentiella nyttan av Trametes versicolor hos kvinnor med bröstcancer behövdes en doseskaleringsstudie för att utvärdera säkerhet och tolerabilitet. I detta syfte genomförde ett multidisciplinärt team från University of Minnesota och Bastyr University en fas 1-doseskaleringsstudie för att fastställa säkerheten och den maximalt tolererade dosen av Tv hos kvinnor med diagnostiserad bröstcancer som genomgick standardbehandling för bröstcancer och som var villiga att delta i en nioveckorsstudie efter strålbehandlingen.

2. Metoder

2.1. Studiens doseskalering

En standardiserad fas 1-design användes med 3 försökspersoner per dosnivå tills MTD (maximalt tolererad dos) uppnås. Doseskalationsschema för varje kohort av Tv var en 3 gm (den mest använda dosen); 6 gm; 9 gm; 12 gm; 18 gm; 24 gm. Denna studie rekryterade endast genom kohorten med nio gram (𝑁=9).

2.2. Deltagare i studien

Kvinnor mellan 21 och 75 år, som hade diagnostiserats med bröstcancer i stadium I, II eller III och som hade genomgått kirurgi och kemoterapi och var redo att påbörja strålbehandling, rekryterades till studien efter att ha gett sitt skriftliga samtycke. Tillhörighet innefattade också att man var villig att äta en konsekvent diet under hela studien och undvika kostkällor av svamp och andra växtbaserade produkter med rapporterade immunmodulerande effekter under strålbehandlingen och fram till studiens slutförande. Hämatologiska, renala och hepatiska baslinjefunktioner inom normala gränser krävdes före inskrivning i studien. Studien genomfördes vid Cancer Center vid University of Minnesota i Minneapolis, Minnesota och Bastyr University i Ken more, Washington. Studien godkändes av IRB-kommittéerna vid University of Minnesota och Bastyr University. Mellan januari 2008 och juni 2010 uppfyllde elva kvinnor med bröstcancer i stadium I-III de snäva kriterierna för denna studie, gav sitt samtycke till att delta och rekryterades sekventiellt från kohorten med den lägsta dosen. Tre deltagare i var och en av kohorterna med 3 gm, 6 gm och 9 gm slutförde studien. Två av deltagarna drog sig ur studien efter besök två på grund av svårigheter med transport till kliniken. Karaktäristika för de nio kvinnor som fullföljde studien omfattade ett åldersspann från 38 till 68 år, sex ER-negativa och tre ER-positiva, tre stadium I, två stadium II och fyra stadium III bröstcancer. En av de kvinnor som genomförde studien genomgick inte kemoterapi före strålning, och ett brott mot protokollet rapporterades till IRB.

2.3. Resultatmått

Det primära målet med studien var att utvärdera säkerheten och tolerabiliteten av Trametes versicolor hos kvinnor med bröstcancer efter strålbehandling. De nio deltagarna i doseskalationsstudien övervakades med avseende på biverkningar (AE) med hjälp av både kliniska metoder och laboratoriemetoder och kriterier för dosbegränsande toxicitet (DLT) som definierades som varje behandlingsrelaterad toxicitet av grad 2 eller högre enligt poängsättning med hjälp av NCI:s Common Terminology Criteria for Adverse Events V 3.0 (CTCAE). Kvinnor undersöktes varje vecka för biverkningar under administrering av produkten, antingen vid deras klinikbesök eller genom telefonscreening mellan besöken. Det sekundära målet var att samla in preliminära data som jämförde baslinjer före och efter strålbehandling, immunologiska mått före och efter behandling, inklusive komplett blodstatus med differentialräkning, natural killer (NK)-cellsaktivitet, T-regulatorisk cellassay, T/B/NK-cellsubsetassay, fagocytiskt index och cytokinnivåer. Statistisk analys, inklusive t-test för oberoende prov och envägs-ANOVAs med Turkey post hoc multipel jämförelse, utfördes med GraphPad Prism, version 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). För att öka styrkan och urvalsstorleken kombinerades data från en observationsstudie (𝑁=14) som genomförts av våra centra sedan 2006 med den aktuella doseskaleringsstudien (𝑁=9). Urvalskriterierna var identiska för båda studierna (𝑁=23).

2.4. Svampläkemedel

Trametes versicolor frystorkat mycelpulver erhölls från Paul Stamets på Fungi Perfecti, Inc., Olympia, WA och inkapslades av Beehive Botanicals (Hayward, WI). Varje kapsel innehöll 500 mg av produkten. FDA:s IND-godkännande (nr 75 405) erhölls 2007.

2.5. Immunförsvarets anfall

2.5.1. Complete Blood Count with Differential

De kliniska laboratorietesterna (CBC, kemi, serumgraviditetstester och urinanalys) utfördes vid avdelningen för laboratoriemedicin vid University of Washington för deltagare som rekryterades vid Bastyr Universitys anläggning och vid University of Minnesota Fairview Diagnostic Laboratory för deltagare som rekryterades vid U of Minnesota-anläggningen.

2.5.2. Natural Killer Cell Functional Activity

Den subgrupp av immunceller som mättes omfattade NK-cellsaktivitet, T-regulatorisk cellanalys, T/B/NK-cellsubgruppanalys, fagocytiskt index och cytokinnivåer. Immunologiska analyser utfördes vid Bastyr Universitys laboratorium för försökspersoner som rekryterats från båda ställena. Blod som samlades in vid University of Minnesota General Clinical Research Center (GCRC) skickades över natten till Bastyr University. Kvaliteten på det transporterade blodet från University of Minnesota till Bastyr bedömdes enligt följande kriterier. För prover som var äldre än 48 timmar när de anlände till Bastyr-laboratoriet isolerades lymfocyterna och celllivsligheten bestämdes med hjälp av trypanblå färgning. Om livsdugligheten var större än 80 % utfördes analysen. Om livsdugligheten var mindre än 80 % avvisades proverna. Mononukleära celler från perifert blod (PBMC) isolerades genom Ficoll-Hypaque gradient (densitet = 1,070 g/mL), tvättades två gånger i PBS och hölls i RPMI 1640, 10 % FBS med 2 mM L-Gln och penicillin-streptomycin (1000 U/mL; 1 mg/mL). NK-cellsaktiviteten hos dessa PBMC-prover, mätt som förmågan att döda K562-tumörmålceller, bedömdes i tre exemplar i förhållandet effektor till mål (E : T) på 50 : 1, 25 : 1 och 12,5 : 1 enligt publicerade metoder . Målcellerna märktes med 3,3′-dioctadecyloxakarbocyaninperklorat (DiOC18) och samodlades med PBMC-effektorceller i fyra timmar. Ett kontrollprov med enbart K562-celler ingick för att fastställa spontan målcellsdöd. Efter inkubation tillsattes propidiumjodid för att upptäcka döda celler. Procentandelen dödade målceller bestämdes genom att subtrahera procentandelen spontana lyser från den procentuella specifika lysen (PSL) för respektive E : T-förhållandet. För att representera standardiserad NK-cellaktivitet beräknades lytiska enheter med hjälp av ett tidigare publicerat och validerat program med följande parametrar: mål per brunn = 10 000; LU per cellnummer = 107; kurva maximalt = 48; procent lyser = 20 . LU20-värden, definierade som E : T-förhållandet vid vilket 20 % av målcellsdöden inträffar extrapolerades från dos-responskurvor för PSL mot log E : T-förhållandet för varje blodprov som undersökts .

2.5.3. Immunfenotyping PBMC Subsets

PBMC-suspensioner (5×105 celler) sattes i tre rör, tvättades i PBS, snurrades, supernatanter som piratkopierades och cellpellets resuspenderades i 100 μL PBS. PBMC i rör 1 färgades med CD3-PC5, CD4-PE och CD8-FITC; rör 2: CD3-PC5, CD16-FITC och CD56-PE; rör 3: CD14-PC5. Rören vortexades kort, täcktes och inkuberades på is i 15 minuter, varefter cellerna tvättades i kallt PBS två gånger, resuspenderades till 0,5 ml i PBS och procentuella PBMC-undergrupper bestämdes genom flödescytometrisk analys med hjälp av Beckman Coulter FC500 och CXP-programvaran.

2.6. Kliniskt försöksprotokoll

Studietiden var nio veckor och inleddes efter avslutad strålbehandling. Den omfattade sex veckors produktanvändning följt av en tre veckors tvättperiod utan produktanvändning (figur 1). Patienterna screenades och bedömdes vara berättigade till studien efter avslutad kemoterapi och innan strålbehandlingen påbörjades. Studien krävde sex besök på de kliniska forskningscentren. Det första studiebesöket ägde rum innan strålbehandlingen påbörjades, och vid detta tillfälle togs baslinjelaboratorier. Inom den första veckan efter avslutad strålning hade deltagarna sitt andra besök då laboratorieprover togs och den nio veckor långa studien inleddes. Deltagaren fick sex veckors Tv-produkt och återvände till forskningscentret för besök tre, fyra och fem med två veckors mellanrum för laboratorieuttag och bedömning av produktens tolerabilitet och biverkningar. Det sista (sjätte) besöket var vid nio veckor, efter tre veckor utan produkt, för en sista laboratorieuttagning och bedömning av eventuella förlängda biverkningar.

3. Resultat

3.1. Biverkningar

Resultaten från denna doseskaleringsstudie visade att upp till 9 gram/dag av Tv-preparatet tolererades väl hos kvinnor med bröstcancer under sex veckor i samband med behandling efter strålning. Det fanns nio biverkningar; sju milda, en måttlig och endast en biverkning av grad 3 som var en ångestattack hos en deltagare som sannolikt inte var relaterad till studiens medicinering (tabell 2). Andra rapporterade milda biverkningar omfattade övergående hjärtbränna, hjärtklappning, förstoppning, bröstsmärta, feber, strålningsdermatit och förkylnings-/ influensasymptom. Alla tre doser tolererades väl och deltagarna hade inga svårigheter att svälja upp till 9 kapslar tre gånger dagligen. Noterbart är att varken illamående eller gastrointestinala besvär rapporterades; två biverkningar rapporterades i tidigare kliniska prövningar av andra Tv-extrakt.

3.2. Immunrespons

Det röda blodkroppsfacket var opåverkat av både strålbehandling (RT) och Tv-administration. Absolut antal röda blodkroppar, hemoglobin och hematokrit var normala vid besök ett, vilket var dagen innan RT började, och fortsatte att falla inom normala gränser under resten av studien. Det absoluta antalet vita blodkroppar och antalet neutrofiler låg i allmänhet inom normala gränser för alla kvinnor både före och efter RT och under veckorna efter RT medan de tog Tv (data visas inte). Det absoluta antalet lymfocyter visade dock ett annat mönster än de andra CBC-undergrupperna. Eftersom urvalskriterierna var identiska i de studier som utförts av våra centra sedan 2006, kombinerade vi för att öka styrkan data från vår observationsstudie (𝑁=14) som visade att RT gav upphov till immundefekter hos kvinnor med bröstcancer i stadium I-III med vår nuvarande doseskaleringsstudie (𝑁=9). För det kombinerade antalet 23 kvinnor i båda studierna med bröstcancerstatus i stadium I-III efter bröstkirurgi och kemoterapi som sedan fick strålbehandling var lymfocyterna inom normala gränser före RT men sjönk till onormalt låga nivåer efter RT. Det genomsnittliga antalet lymfocyter för alla 23 försökspersoner före RT var 1,027±0,298 och sjönk med 20 % efter RT till 0,681±0,254, en skillnad som var statistiskt signifikant . I doseskalationsstudien resulterade de två högre orala doserna (6 och 9 g) av Tv i en tidigare återhämtning av lymfocytantalet (figur 2). Antalet lymfocyter återhämtade sig gradvis för observationsgruppen, men det genomsnittliga antalet lymfocyter förblev lägre än för kohorterna med 6 och 9 g Tv vid 6 veckor efter RT. På grund av det lilla antalet för varje doskohort (𝑁=3) hittades statistisk signifikans endast mellan observations- och 9 g Tv-gruppen vid tidpunkten 2 veckor efter strålbehandling. Strålbehandling sänkte statistiskt signifikant det absoluta antalet lymfocyter hos kvinnor med bröstcancer i stadium I-III som har genomgått kirurgi och kemoterapi (se figur 2).

Den funktionella aktiviteten hos de naturliga mördarcellerna var dramatiskt reducerad från pre-. till post-RT för alla 23 bröstcancerpatienter som genomförde de två första besöken i antingen observationsstudien (𝑁=14) eller doseskaleringsstudien (𝑁=9). Figur 3 visar att den genomsnittliga NK-cellaktiviteten var 19,941±18,959 före RT och minskade till 9,872±13,454 efter RT (𝑁=23). Denna minskning var statistiskt signifikant (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). En trend mot ökad NK-cellaktivitet observerades i kohorten med dosen 6 g Tv.

Bestrålningsterapi sänkte statistiskt signifikant NK-cellfunktionen som representeras av LU, vilket beräknas genom 107 dividerade doser med LU20. LU20 är det antal effektorceller (NK) som krävs för att uppnå 20 % specifika lyser på målcellerna (K562). Därför är NK-cellerna effektivare ju mindre LU20 är. Tolkningen av detta resultat kan ha varit svår på grund av olika reaktioner hos individer vid tillskott av svamp. Trenden med tillfällig ökning av NK-cellernas aktivitet observerades i doseringsgruppen med 6 g (se figur 3).

Vi mätte också effekterna av strålbehandling och Tv-administration på T-, B- och NK-cellpopulationer hos de nio patienter som fullföljde doseskaleringsstudien i fas I. Från WBC- och flödescytometriimmunofenotyperingsdata beräknades det absoluta värdet (mm3). Strålbehandling hade en obetydlig effekt på CD4+ och CD8+ T-celler, CD19+ B-celler och CD16+/56+ NK-cellpopulationer. Eftersom immunfenotypning inte utfördes i observationsstudien var antalet sammansatta poäng (före och efter bestrålning) av dem som deltog i doseskaleringsstudien (𝑁=9). Antalet CD8+ T-celler var inte statistiskt annorlunda före och efter strålbehandlingen (figur 4). Däremot observerades ökningar av CD8+ T-celler och CD19+ B-celler i perifert blod för Tv-tilläggsgrupperna. Antalet CD8+ T-celler under den 9 veckors doseskaleringsstudien ökade i kohorten med 9 gm Tv-dos jämfört med både 3 g- och 6 g-gruppen. Envägs ANOVA användes för att analysera den övergripande skillnaden mellan doseringsgrupperna under behandlingsperioden (2-4-6 veckor). Den visade den statistiskt signifikanta ökningen av CD8+ cytotoxiska T-celler för 9 g-gruppen jämfört med både 3 g- och 6 g-gruppen (𝐹(2,6)=42,04, 𝑃=0,0003). Skillnaden mellan 3 g- och 6 g-gruppen var inte signifikant (se figur 4).

Enligt de sammanvägda värdena för åtta doseskaleringsdeltagare förändrade strålbehandlingen inte signifikant B-cellantalet (figur 5). Tv-administration var dock förknippad med en ökning av CD19+ B-celler. Envägs ANOVA användes för att analysera den totala skillnaden mellan doseringsgrupperna under behandlingsperioden (2-4-6 veckor). Den visade den statistiskt signifikanta ökningen av CD19+ B-celler för doseringsgruppen med 6 g jämfört med 3 g-gruppen . Skillnaden mellan 3 g- och 9 g-grupperna och även 6 g- och 9 g-grupperna var inte signifikant (se figur 5).

Med avseende på antalet CD16+56+ NK-celler observerades inga signifikanta förändringar på grund av vare sig strålbehandling eller Tv-administrering (Figur 6). Eftersom NK-cellaktiviteten både minskade genom RT och ökade i kohorten med 6 grams Tv-dos (figur 3), men NK-cellpopulationerna inte tycktes påverkas signifikant av dessa behandlingar, tyder uppgifterna på att en förstärkning av NK-cellaktiviteten inte beror på behandlingsinducerade förändringar i antalet NK-celler. NK-cellpopulationen påverkades inte av vare sig strålbehandling eller av orala doser av Tv (se figur 6).

4. Diskussion

Resultaten från denna studie fastställer säkerheten av oral administrering av ett Trametes versicolor-preparat (Tv) i doser på 3, 6 och 9 gram, utan några allvarliga biverkningar av denna behandling hos kvinnor efter strålbehandling för behandling av bröstcancer. Den aktuella studien bekräftar vår tidigare rapport om att standardstrålbehandling av bröstcancer i bröstet inte påverkar de röda blodkropparna eller neutrofilerna, men att den framkallar specifika immunbrister, bland annat lymfopeni och nedsatt funktionell aktivitet hos NK-cellerna. NK-cellterapier är på väg att växa fram över hela världen som lovande behandlingar mot cancer, genom att utnyttja NK-effektorernas snabba cytolytiska verkan och deras potentiellt breda tillämplighet mot ett brett spektrum av maligniteter . Vår nya upptäckt är att förlusten av NK-cellernas aktivitet verkar vara oberoende av antalet NK-celler. Här visar vi att RT minskar NK-cellernas aktivitet per NK-cell. Högre orala doser av Tv på 6 och 9 gram/dag var förknippade med snabbare återhämtning av lymfocyter och NK-cellaktivitet samt ökat antal CD8+T-celler och CD19+ B-celler. Det fanns ingen tydlig effekt av Tv på antalet CD 16+/56+ NK-celler, endast på deras funktionella aktivitet. Även om det finns en tendens till att högre Tv-doser har en mer uttalad immunologisk aktivitet, var denna fas I-doseskaleringsstudie inte utformad för att utvärdera dosberoende förändringar i immunmarkörer. Preliminära data med dessa små urval av 3 bröstcancerpatienter per doskohortgrupp som visar dosrelaterade trender leder till den testbara hypotesen att 6 gram Tv kan leda till snabbare immunåterhämtning efter strålbehandling. Resultaten av denna fas I-studie motiverar och står som plattform på vilken randomiserade kontrollerade dos-responsstudier i fas II kan fortsätta.

Och även om denna studie visade säkerhet för Trametes versicolor till en daglig dos på 9 gram var doseskaleringsstudien utformad för att bedöma den maximalt tolererade dosen (MDT); därför fastställde denna studie inte säkerheten och tolerabiliteten vid den högsta dosen. Rekrytering av kvinnor till en kohort på 12 gram och högre uppnåddes inte på grund av flera begränsande faktorer. För det första var kvinnorna tvungna att uppfylla mycket strikta kriterier för att få delta i studien och genomgå kirurgi, kemoterapi och strålning i sitt behandlingsprotokoll. För närvarande får många kvinnor med en bröstcancerdiagnos inte en trippelbehandling. Många kvinnor får diagnosen bröstcancer i stadium 1 och genomgår lumpectomi och strålning, och om deras onkotypscore är låg får de ingen kemoterapi. Dessutom har många kvinnor rekryterats till andra forskningsstudier och har överösts med förfrågningar om att delta i ytterligare studier. Viktigast av allt var att vi fann att kvinnor efter att ha avslutat en lång behandlingsregim med kemoterapi och strålning var ovilliga att delta i en nioveckorsstudie som krävde sex ytterligare besök på universitetet.

Fas I-data tyder på att Tv är en säker immunterapi för bröstcancerpatienter som kan korrigera strålbehandlingsrelaterade immundefekter. Baserat på våra resultat kan behandling med Tv-svamp som administreras oralt efter strålbehandling öka antalet lymfocyter och NK-cellernas tumördödande aktivitet. Återfall efter primär behandling av bröstcancer kan vara relaterat till defekter i det medfödda och adaptiva immunsystemet. Forskningen vid vårt centrum fortsätter att visa att Trametes versicolor utgör en ny immunterapi med betydande tillämpningar inom cancerbehandling.

Ett etiskt godkännande

Alla utförda experiment överensstämmer med gällande lagar i USA.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health/National Center for Complementary and Alternative Medicine (U19 AT 1998) och Gateway for Cancer Research Grant no. G-04-002. Författarna tackar också för redigeringsstödet från Rebekah Pratt från avdelningen för familjemedicin vid U of MN och Daniel Strenge för hans bidrag.