DNA-syntes från difosfat-substrat med DNA-polymeraser

Resultat och diskussion

Vi började med att testa Taq (från Thermus aquaticus), High-fidelity Vent (exo-, från Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, från Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, från Pyrococcus sp. GB-D) och Q5 (exo+) DNA-polymeraser i traditionella polymeraskedjereaktioner (PCR) med desoxyribonukleosidmonofosfat (dGMP), dNDPs och dNTPs som substrat (fig. 1 A och B). Ersättning av någon av dNTP:erna med dNDP:er stödde robust DNA-syntes, och ytterligare experiment med två, tre eller alla fyra dNDP:erna i stället för dNTP:er stödde PCR. För att säkerställa att produkterna inte var resultatet av kontaminerande dNTP:er och att reaktionerna inte förstärktes av stabilisatorer som finns i kommersiella buffertar eller enzymlager testade vi DNA-syntes från renade dNDP:er med hjälp av hemmagjorda buffertar och enzymer. Vi inkluderade också bakteriella replikativa enzymer, t.ex. de bakteriella replikativa DNA-polymeraserna från den termofila Bacillus stearothermophilus (Bst) och den mesofila Bacillus subtilis (Bsu, stort fragment). Dessa, tillsammans med arkealiska polymeraser från Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) och Thermococcus gorganarius (Tgo), uppvisade robusta primerförlängningar med hjälp av endast 100 µM renad dNDPs vid 60 °C (utom Bsu, som testades vid 37 °C i samtliga fall) (fig. 1C). Primerförlängningsreaktionerna var effektiva för alla dessa enzymer, särskilt för Deep Vent, KOD och 9°N. Paus observerades före inkorporering av dA och dC i den framväxande oligonukleotiden (fig. 1 C och D), vilket tyder på att KM för dADP och dCDP är tillräckligt höga för att bromsa primerförlängningen vid en substratkoncentration på 100 µM.

För att få en mekanistisk inblick i reaktionen studerade vi först dess effektivitet med hjälp av Taq-enzymet. Att variera förlängningstemperaturen från 50 °C till 72 °C resulterade inte i någon observerbar skillnad i mängden fullängdsprodukt. För att förenkla de kinetiska analyserna utfördes alla PCR-reaktioner med hjälp av ett tvåstegsprotokoll för temperaturcykling, där primern annealades och förlängdes i det första steget vid 72 °C och duplexen smälte vid 95 °C i det andra steget (Fig. S1A). För att jämföra hastigheterna för dNDP-utnyttjande med de kanoniska dNTP:erna varierades förlängningstiden från 15 till 120 s. För en förlängningstid på 15 s producerade dNTP-reaktionen ungefär fyra gånger så mycket produkt jämfört med reaktionen med en förlängningstid på 2 minuter som innehöll dNDP:erna (fig. S1B). Dessa data tyder på att inkorporeringshastigheten för difosfaterna är långsammare än för de traditionella trifosfaterna, vilket skulle vara förväntat med tanke på dNDPs lägre grundstatens energi. Därefter frågade vi om en enskild eller alla fyra dNDPs är ansvariga för den långsammare inkorporeringshastigheten. Kvantitativ PCR (qPCR) användes för en exakt mätning av produktbildningen. Varje difosfat förhördes oberoende av varandra genom att kombinera den med 0,2 mM av de andra tre dNTP:erna för att amplifiera en lång DNA-mall. Dessa reaktioner normaliserades till en kontrollreaktion som innehöll 0,2 mM av alla fyra dNTP:erna (fig. S1C). Ett värde på 1 indikerar att en difosfat inkorporeras lika effektivt som dess trifosfatanalog. Dessa resultat tyder på att dADP inkorporeras minst effektivt (1 mM dADP gav ∼60 % av 0,2 mM dATP), följt av desoxythymidindifosfat (dTDP) och desoxycytidindifosfat (dCDP). Å andra sidan krävs endast en tvåfaldig ökning av koncentrationen av dGDP för att uppnå samma PCR-effektivitet som dGTP-kontrollreaktionen.

För att analysera DNA-polymeriseringen direkt utförde vi en primerförlängningsreaktion av en 32P-märkt primer och en lång (706 nt) mall. Difosfatkoncentrationen varierade från 0,1 till 1,0 mM och kombinerades med 0,2 mM av de andra tre dNTP:erna, i likhet med de qPCR-reaktioner som beskrivs ovan. Som förväntat minskade ökande koncentrationer av dADP den tid som krävdes för att producera fullängdsprodukt (fig. 1E). Pausering längs mall-DNA:s längd observerades endast i fallet med dADP, vilket tyder på att polymeraset stannar upp under inkorporeringen av dADP-substrat (fig. 1E). Å andra sidan tydde avsaknaden av paus i dTDP-reaktionen på att dTDP utnyttjades mer effektivt än dADP (fig. S2A), vilket qPCR-analysen (fig. S1A) tyder på. Analys av produktbildningen tydde på att dADP-koncentrationen som krävs för att nå halvmaximal hastighet är ∼420 µM (Fig. S2B), mer än en storleksordning över KM för dNTPs som uppmätts tidigare (16 och 24 µM) (5, 6). Nära mättad koncentration av dADP syntetiseras det fullständiga DNA:t på cirka 30 s och med tanke på att 706-nt-sekvensen innehåller 182 adenosiner är den genomsnittliga hastigheten för utnyttjandet av dADP minst ∼6 s-1. Detta är ungefär en storleksordning långsammare än den genomsnittliga hastigheten för utnyttjandet av dNTPs av Taq-polymeraset (kcat = 47 s-1) och ligger inom 1,5 gånger kcat för Pfu (7).

För att ytterligare jämföra kinetiken för DNA-syntesen på långa mallar från dNDPs och dNTPs, använde vi en mall av singelsträngat DNA (ssDNA) M13mp18-plasmidmall på 7 249 nt (8). Bsu- (vid 37 °C), Bst- och Taq-polymeraserna (vid 60 °C) visade robust DNA-syntes från dNDPs (fig. S2C). Vi mätte hastigheten för DNA-syntesen med hjälp av fluorescensen hos interkalatorn SYTO9, som observerades av en termocyklare i realtid vid varierande dNDP- och dNTP-koncentrationer (fig. S2D) (9). En plott av dessa hastigheter mot nukleotidkoncentrationen avslöjade en skenbar KM på ∼0,4 mM för dNDPs och en maximal synteshastighet som är ungefär 17 gånger lägre för dNDPs än för dNTPs (Fig. S2E). Dessa resultat visar, i en direkt jämförelse under identiska förhållanden, att DNA-synteshastigheten från dNDPs är drygt en storleksordning lägre än från dNTPs och att Vmax/KM därmed är cirka 400 gånger lägre för dNDPs än för dNTPs.

En polymeriseringsreaktion med kanoniska trifosfat-substrat ökar längden på den nascenta DNA-strängen med en nukleotid, vilket frigör en PPi (3). Under den omvända reaktionen, pyrofosforolys, förkortas primern med en nukleotid och en dNTP frigörs. På motsvarande sätt, när dNDPs används som substrat, frigör polymeraserna fosfater och den omvända reaktionen är fosforolys av DNA (fig. 2A). För att bekräfta att polymeraserna utnyttjar dNDPs direkt och inte använder en hittills okänd enzymatisk aktivitet (eller sampurifierat nukleotiddifosfatkinas) som omvandlar två dNDPs till en dNTP och en dNMP, använde vi renade dNDPs och analyserade produkterna från en primerextensionsreaktion. Vi mätte produktionen av fosfat med hjälp av en fluorescerande sensor, som härrör från det bakteriella fosfatbindande proteinet och uppvisar en hög specificitet för fosfat (10). Vi fann att i närvaro av renade dNDPs och Taq DNA-polymeras byggs fosfat upp (fig. 2B), men i experiment utan polymeras gör det inte det. I kontrollexperiment med dNTP:er observerades fosfatproduktion, men dess hastighet var långsammare och oberoende av enzymet, vilket tyder på att det upptäckta fosfatet berodde på dNTP-nedbrytning till dNDP och fosfat och inte var relaterat till DNA-syntesen. Dessa resultat bekräftade att Taq direkt utnyttjar dNDPs som substrat och frigör fosfat som biprodukt av DNA-syntesen. När vi mätte mängden fosfat som producerades i primerförlängningar på det 7 249-nt M13 ssDNA som beskrivits ovan, fann vi att ∼1-11 µM fosfat producerades med hjälp av en 1,6-nM-mall över bakgrundsfosfatproduktion från dNDP-nedbrytning (Fig. S3A). Denna fosfatkoncentration motsvarar ∼2-6 000 molekyler per DNA, eller cirka 0,1-0,9 av den mall som kopierats med hjälp av dNDPs. Det stora intervallet beror på en relativt stor fosfatbakgrund i utgångsmaterialet och att bakgrundsreaktionen subtraheras från signalen i primerextensionsreaktionen.

För att verifiera att reaktionerna inte producerar dNTP:er från dNDP:er inkuberade vi Taq-polymeraset med 250 µM dCDP och dTDP och löste upp reaktionerna med jonbyteskromatografi (fig. S3B). Denna analys avslöjade inga nya molekylära arter som motsvarar mono- eller trifosforylerade nukleotider i den enzyminnehållande reaktionen, jämfört med den enzymfria reaktionen, vilket tyder på avsaknad av fosforylöverföringsaktivitet i enzympreparatet och ytterligare stödjer ett direkt utnyttjande av dNDPs i DNA-syntesen.

Som beskrivits ovan frigör reaktioner med dNDP-substrat ett oorganiskt fosfat (Pi), och den omvända reaktionen är således fosforolys av DNA (fig. 2A). För att testa effektiviteten hos denna omvända reaktion undersökte vi fosforolysen av en 5′ 32P-märkt primer som annekterats till en mallsträng genom att inkubera den med enzymet och 10 mM Pi. Fig. 2C visar avlägsnandet av den terminala 3′-nukleoiden från primersträngen av Taq DNA-polymeras i närvaro av Pi och PPi, vilket visar att Taq DNA-polymeras kan genomgå den omvända reaktionen av DNA-polymerisation från både dNTPs och dNDPs. Analyser av de termofila polymeraserna Bst, Deep Vent, KOD (fig. S4A), 9°N, Tgo och de mesofila Bsu-polymeraserna visade också fosforolys av DNA (fig. S4B), om än i mindre utsträckning. En kontrollreaktion med Klenow-fragmentet av Escherichia coli DNA-polymeras I, som inte accepterar dNDPs som substrat, undersöktes också (Fig. S4C) och visade att närvaron av PPi, men inte Pi, resulterar i en förkortning av primern.

För att ytterligare analysera den omvända reaktionen framställde vi dsDNA som var internt märkt med 32P-fosfat genom att utföra en primerförlängningsreaktion med α-32P-dATP, följt av PAGE-rensning. Vi analyserade produkterna från den omvända reaktionen med hjälp av TLC med anjonbyte (polyetylenimin). Som förväntat gav inkubation av det internt märkta DNA:t med Taq-polymeras och pyrofosfat produkter som komigrerade med dATP. Reaktioner i närvaro av fosfat gav snabbare migrerande arter, motsvarande dADP, och reaktioner utan fosfat eller pyrofosfat gav inga migrerande arter, vilket tyder på att i närvaro av enbart Taq-polymeras förblev DNA intakt (fig. 2D) och bekräftar att den omvända reaktionen är fosforolys av DNA.

För att slutligen analysera den substratberoende kinetiken för den omvända reaktionen visade en KM på ∼10 ± 5 mM (n = 9) och 57 ± 5 µM (n = 5) för fosfat respektive pyrofosfat, även om den låga lösligheten hos magnesiumfosfat över 10 mM hindrade oss från att erhålla exakta mätningar (fig. 2E). Kristallstrukturer av DNA-polymeraser med pyrofosfat eller fosfonoforminsyra i de aktiva platserna visar en coulombisk interaktion med proteinet (11⇓-13). Det 200-faldiga förhållandet mellan KMs för de två substraten motsvarar ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) vid 72 °C, en bindningsenergi som är ungefär lika stor som en jonisk växelverkan mellan den extra fosfaten och en kompenserande katjon på proteinet och som stödjer en modell där fosfat/pyrofosfat främst känns igen genom en laddnings-laddningsinteraktion. Uppskattningar av de maximala hastigheterna för den omvända reaktionen följde en liknande trend: under dessa förhållanden var Vmax 0,0010 ± 0,0005 s-1 och 0,205 ± 0,005 s-1 för fosfat respektive pyrofosfat, vilket återigen avslöjar ett ungefär 200-faldigt förhållande mellan de två aktiviteterna. Sammantaget är fosfatreaktionen under mättande koncentrationer av de två substraten cirka 4 × 104 gånger mindre effektiv, vilket tyder på att fosforolys av DNA inte utgör något betydande hot mot genomets stabilitet.

För att få ytterligare insikt i DNA-syntesen från substrat med låg energi (dNDPs och Pi) mätte vi aktiveringsenergierna med hjälp av Arrhenius-analysen av de framåtgående och omvända reaktionerna. Eftersom mätningar av enstaka molekyler av konformationsförändringar i samband med igenkänning och inkorporering av de korrekta dNTP:erna avslöjade en snabbare proteinrörelse än den observerade reaktionskinetiken (14), är det hastighetsbegränsande steget i den framåtriktade reaktionen i Taq-polymeraset troligen relaterat till kemisteget eller en prekatalytisk omarrangemang av den aktiva platsen som beror på interaktionen med substratfosfaterna. Vi observerade att Vmax för både framåt- och bakåtriktade reaktioner är lägre för dNDP och fosfat än för dNTP och pyrofosfat, vilket tyder på att det hastighetsbegränsande steget är känsligt för substratens fosforyleringstillstånd. Både den förkatalytiska omläggningen (t.ex. anpassning av rester på den aktiva platsen och bindning av en katalytisk Mg2+-jon) och det kemiska steget kan dock påverkas av substratfosforyleringen. Därför kan båda stegen vara hastighetsbegränsande i närvaro av dNDPs, förutsatt att de inte introducerar ett nytt långsamt konformationellt steg i mekanismen. I Pol β har dessa två steg tidigare föreslagits ha liknande hastighetskonstanter (15), och de beräknade aktiveringsenergierna för de framåtriktade och omvända reaktionerna som utnyttjar de energirika substraten (dNTPs och pyrofosfat) skiljer sig med så lite som 15 kJ/mol (4). När det gäller de termofila enzymerna Taq och Klentaq1 varierar aktiveringsenergin för den framåtriktade reaktionen kraftigt, från 90 till 125 kJ/mol, beroende på de experimentella förhållandena och troligen identiteten hos de reagerande nukleotiderna (8, 16), medan aktiveringsenergin för pyrofosforolysen, såvitt vi vet, inte har bestämts experimentellt.

Vi analyserade inkorporeringshastigheten för enskilda nukleotider av 50 µM dCDP, dADP och dTDP, som staplas på dA, dC respektive dA, under primerextensionsreaktionen. Arrheniusanalysen visade ett linjärt beroende av ln(kobs) på 1/T för experiment under 60 °C, vilket avslöjade aktiveringsenergier på 85 ± 14, 108 ± 11 och 112 ± 15 kJ/mol för de tre nukleotiderna (fig. 3 A och B; n = 6 för varje nukleotid). Arrheniusanalys av den omvända reaktionen med 0,4 mM fosfat, som ger en molekyl dADP, avslöjade en stor aktiveringsenergi på 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), vilket stämmer överens med den observerade långsamma hastigheten för DNA-fosforolysen med Taq (fig. 3 A och B) och utgör en betydande ökning jämfört med den beräknade aktiveringsenergin för pyrofosforolysen (92 kJ/mol i Pol β) (4). Aktiveringsenergin för framåt- och bakåtriktade reaktioner för dADP skiljer sig således med ∼30 kJ/mol, vilket ger en stark bias för DNA-syntes. Denna bias för den framåtriktade reaktionen resulterar i ett lägre krav på sekretering av fosfatprodukten genom en nedströms metabolisk väg, till skillnad från den dNTP-baserade DNA-syntesen och pyrofosfathydrolysen genom oorganiska pyrofosfataser. Om de prekatalytiska konformationsförändringarna i Taq-polymeraset inte påverkas av de lågenergiska substraten och kemisteget är hastighetsbegränsande kan utnyttjandet av dNDPs och fosfater dessutom ge nya experimentella insikter i den enzymatiska katalysen av DNA-syntesen.