Pentru a studia efectul creșterii concentrației enzimei asupra vitezei de reacție, substratul trebuie să fie prezent într-o cantitate în exces; adică reacția trebuie să fie independentă de concentrația substratului. Orice modificare a cantității de produs format într-o anumită perioadă de timp va depinde de nivelul de enzimă prezentă. Din punct de vedere grafic, aceasta poate fi reprezentată astfel:
Aceste reacții se spune că sunt de „ordin zero”, deoarece vitezele sunt independente de concentrația de substrat și sunt egale cu o anumită constantă k. Formarea produsului are loc cu o viteză care este liniară cu timpul. Adăugarea de mai mult substrat nu servește la creșterea vitezei. În cazul cineticii de ordin zero, dacă se permite ca testul să se desfășoare timp dublu, rezultă o cantitate dublă de produs.
| Ordine | Ecuația vitezei | |
|---|---|---|
| viteză zero | viteză = k | rata este independentă de concentrația substratului |
| prima | rata = k | rata este proporțională cu prima putere a concentrației substratului |
| a doua | rata = k=k2 | rata este proporțională cu pătratul concentrației substratului |
| a doua | rata = k | viteza este proporțională cu prima putere a fiecăruia dintre cei doi reactanți |
Cantitatea de enzimă prezentă într-o reacție se măsoară prin activitatea pe care o catalizează. Relația dintre activitate și concentrație este afectată de mulți factori, cum ar fi temperatura, pH-ul etc. Un test enzimatic trebuie conceput astfel încât activitatea observată să fie proporțională cu cantitatea de enzimă prezentă, pentru ca concentrația enzimei să fie singurul factor limitativ. Aceasta este satisfăcută numai atunci când reacția este de ordin zero.
În figura 5, activitatea este direct proporțională cu concentrația în zona AB, dar nu și în BC. Activitatea enzimatică este, în general, cea mai mare atunci când concentrația substratului nu este limitativă.
Când concentrația produsului unei reacții enzimatice este reprezentată grafic în funcție de timp, rezultă o curbă similară, figura 6.
Între A și B, curba reprezintă o reacție de ordin zero; adică una în care viteza este constantă în timp. Pe măsură ce substratul este epuizat, situsurile active ale enzimei nu mai sunt saturate, concentrația de substrat devine limitatoare de viteză, iar reacția devine de ordinul întâi între B și C.
Pentru a măsura în mod ideal activitatea enzimatică, măsurătorile trebuie făcute în acea porțiune a curbei în care reacția este de ordin zero. Este foarte probabil ca o reacție să fie inițial de ordin zero, deoarece concentrația de substrat este atunci cea mai mare. Pentru a fi siguri că o reacție este de ordin zero, trebuie efectuate mai multe măsurători ale concentrației produsului (sau substratului).
Figura 7 ilustrează trei tipuri de reacții care pot fi întâlnite în testele enzimatice și arată problemele care pot fi întâmpinate dacă se fac numai măsurători unice.
B este o linie dreaptă care reprezintă o reacție de ordin zero care permite determinarea precisă a activității enzimatice pentru o parte sau pentru tot timpul de reacție. A reprezintă tipul de reacție care a fost prezentat în figura 6. Această reacție este de ordin zero inițial și apoi încetinește, probabil din cauza epuizării substratului sau a inhibării produsului. Acest tip de reacție este denumit uneori o reacție „de conducere”. Adevărata activitate „potențială” este reprezentată de linia punctată. Curba C reprezintă o reacție cu o fază inițială de „întârziere”. Din nou, linia punctată reprezintă activitatea potențial măsurabilă. Determinările multiple ale concentrației produsului permit trasarea fiecărei curbe și determinarea activității reale. O singură determinare a punctului final la E ar duce la concluzia falsă că toate cele trei probe au o concentrație identică de enzimă.
.