Síntese de DNA de substratos de difosfato por polimerases de DNA

Resultados e Discussão

Comecemos por testar Taq (de Thermus aquaticus), Vent de alta fidelidade (exo-, de Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, de Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, de Pyrococcus sp. GB-D), e Q5 (exo+) DNA polimerases em reacções em cadeia da polimerase tradicional (PCR) com um monofosfato de desoxirribonucleósido (dGMP), dNDPs, e dNTPs como substratos (Fig. 1 A e B). A substituição de qualquer um dos dNTPs por dNDPs suportou uma síntese robusta de DNA, e outros experimentos com dois, três, ou todos os quatro dNDPs em vez de dNTPs suportaram PCR. Para assegurar que os produtos não resultassem de dNTPs contaminantes e que as reações não fossem melhoradas por estabilizadores presentes em buffers comerciais ou estoques de enzimas, nós testamos a síntese de DNA de dNDPs purificados usando buffers e enzimas caseiras. Também incluímos enzimas replicadoras de bactérias, como as polimerases de DNA replicadoras de bactérias do Bacillus stearothermophilus (Bst) e do Bacillus subtilis (Bsu, grande fragmento) mesófilo. Estas, juntamente com as polimerases arqueológicas de Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N), e Thermococcus gorganarius (Tgo), mostraram extensões primer robustas usando apenas 100 µM de dNDPs purificados a 60 °C (exceto Bsu, que foi testado a 37 °C em todas as instâncias) (Fig. 1C). As reações de primer-extensão foram eficientes para todas estas enzimas, particularmente para Deep Vent, KOD, e 9°N. Pausa foi observada antes da incorporação de dA e dC no oligonucleotídeo nascente (Fig. 1 C e D), sugerindo que os KMs para o dADP e dCDP são altos o suficiente para retardar a extensão do primer a uma concentração de 100µM do substrato.

Para obter uma visão mecanicista da reacção, estudámos primeiro a sua eficiência utilizando a enzima Taq. Variando a temperatura de extensão de 50 °C para 72 °C, não se observou diferença na quantidade de produto a todo o comprimento. Para simplificar as análises cinéticas, todas as reacções de PCR foram realizadas utilizando um protocolo de ciclos de temperatura em duas etapas, em que o primário foi recozido e prolongado no primeiro passo a 72 °C e o duplex derretido a 95 °C no segundo passo (Fig. S1A). Para comparar as taxas de utilização do dNDP com os dNTPs canônicos, o tempo de extensão variou de 15 a 120 s. Para um tempo de extensão de 15 s, a reação dNTP produziu aproximadamente quatro vezes o produto comparado com a reação de 2 minutos de tempo de extensão que continha os dNDPs (Fig. S1B). Estes dados sugerem que a taxa de incorporação dos difosfatos é mais lenta do que a dos trifosfatos tradicionais, como seria de se esperar considerando a menor energia do estado do solo dos dNDPs. Em seguida perguntamos se um único ou todos os quatro dNDPs são responsáveis pela taxa de incorporação mais lenta. A PCR quantitativa (qPCR) foi utilizada para uma medição precisa da formação do produto. Cada difosfato foi interrogado independentemente, combinando-o com 0,2 mM dos outros três dNTPs para amplificar um modelo de DNA longo. Essas reações foram normalizadas para uma reação de controle, que continha 0,2 mM dos quatro dNTPs (Fig. S1C). Um valor de 1 indica que um difosfato é incorporado tão eficientemente quanto o seu análogo trifosfato. Estes resultados sugerem que o dADP é incorporado de forma menos eficiente (1 mM de dADP rendeu ao ∼60% de 0,2 mM dATP), seguido pelo difosfato deoxitymidina (dTDP) e difosfato de desoxittidina (dCDP). Por outro lado, apenas um aumento de duas vezes na concentração de dGDP é necessário para alcançar a mesma eficiência de PCR da reação de controle dGTP.

Para analisar diretamente a polimerização do DNA, realizamos uma reação de extensão de primer de um primer marcado com 32P e um modelo longo (706 nt). A concentração de difosfato variou de 0,1 a 1,0 mM e combinada com 0,2 mM dos outros três dNTPs, semelhante às reações qPCR descritas acima. Como esperado, o aumento das concentrações de dADP diminuiu o tempo necessário para produzir um produto completo (Fig. 1E). Pausa ao longo do comprimento do DNA modelo foi observada apenas no caso do dADP, sugerindo que as bancas de polimerase durante a incorporação de substratos de dADP (Fig. 1E). Por outro lado, a falta de pausa na reação dTDP sugeriu que o dTDP foi utilizado de forma mais eficiente que o dADP (Fig. S2A), como sugerido pela análise qPCR (Fig. S1A). A análise da formação do produto sugeriu que a concentração de dADP necessária para atingir a taxa semimáxima é ∼420 µM (Fig. S2B), mais do que uma ordem de magnitude acima de KM para dNTPs medidas anteriormente (16 e 24 µM) (5, 6). Perto da concentração saturadora do dADP, o ADN de comprimento total é sintetizado em cerca de 30 s e, dado que a sequência 706-nt contém 182 adenosinas, a velocidade média de utilização do dADP é de pelo menos ∼6 s-1. Trata-se de uma ordem de magnitude mais lenta do que a velocidade média de utilização de dNTPs pela Taq polimerase (kcat = 47 s-1) e está a 1,5 vezes o kcat de Pfu (7).

Para comparar ainda mais a cinética da síntese de DNA em modelos longos de dNDPs e dNTPs, utilizamos um modelo plasmídeo M13mp18 de 7.249 nt (8) de ADN singe-stranded (ssDNA). As polimerases Bsu (a 37 °C), Bst, e Taq (a 60 °C) mostraram uma síntese robusta de DNA a partir de dNDPs (Fig. S2C). Medimos a taxa de síntese de DNA usando a fluorescência do intercalador SYTO9, observada por um termociclador em tempo real com concentrações variáveis de dNDP e dNTP (Fig. S2D) (9). Um gráfico dessas taxas versus concentração de nucleotídeos revelou um KM aparente de ∼0.4 mM para dNDPs e uma taxa máxima de síntese cerca de 17 vezes menor para dNDPs do que para dNTPs (Fig. S2E). Estes resultados mostram, em uma comparação direta sob condições idênticas, que a taxa de síntese de DNA dos dNDPs é um pouco acima de uma ordem de magnitude inferior à dos dNTPs e que Vmax/KM é assim cerca de 400 vezes menor para dNDPs do que para dNTPs.

Uma reação de polimerização com substratos de trifosfato canônico aumenta o comprimento da cadeia nascente de DNA por um nucleotídeo, liberando um PPi (3). Durante a reação inversa, pirofosforólise, o primer é encurtado por um nucleotídeo e um dNTP é liberado. Analogamente, quando dNDPs são usados como substratos, as polimerases liberam fosfatos, e a reação reversa é a fosforólise do DNA (Fig. 2A). Para confirmar que as polimerases utilizam dNDPs diretamente e não utilizam uma atividade enzimática até então desconhecida (ou uma quinase de difosfato de nucleotídeos copurificada) que converte dois dNDPs em um dNTP e um dNMP, utilizamos dNDPs purificados e analisamos os produtos de uma reação de primer-extensão. Medimos a produção de fosfato usando um sensor fluorescente, que é derivado da proteína de ligação ao fosfato bacteriano e apresenta uma alta especificidade para o fosfato (10). Verificamos que, na presença de dNDPs purificados e Taq DNA polimerase, o fosfato se acumula (Fig. 2B), mas em experimentos sem a polimerase, não se acumula. Em experimentos de controle com dNTPs, a produção de fosfato foi observada, mas sua taxa foi mais lenta e independente da enzima, sugerindo que o fosfato detectado resultou da degradação do dNTP para o dNDP e fosfato e não estava relacionado à síntese de DNA. Estes resultados confirmaram que a Taq utiliza diretamente os dNDPs como substratos, liberando fosfato como subproduto da síntese do DNA. Quando medimos a quantidade de fosfato produzido em extensões de primer sobre o 7.249-nt M13 ssDNA descrito acima, encontramos que ∼1-11 µM fosfato foi produzido usando um modelo de 1,6-nM sobre a produção de fosfato de fundo a partir da degradação do dNDP (Fig. S3A). Esta concentração de fosfato corresponde a ∼2-6.000 moléculas por DNA, ou cerca de 0,1-0,9 do modelo copiado usando dNDPs. A ampla faixa resulta de um fundo de fosfato relativamente grande no material inicial e a reação de fundo subtraída do sinal na reação de extensão do primer.

Para verificar se as reações não produzem dNTPs de dNDPs, incubamos a Taq polimerase com 250 µM de dCDP e dTDP e resolvemos as reações por cromatografia de troca iônica (Fig. S3B). Esta análise não revelou nenhuma nova espécie molecular correspondente aos nucleotídeos mono ou trifosfóricos na reação contendo enzimas, em comparação com a reação livre de enzimas, indicando uma falta de atividade de fosforil transferase no preparo da enzima e suportando ainda a utilização direta de dNDPs na síntese de DNA.

Como descrito acima, as reações com substratos de dNDP liberam um fosfato inorgânico (Pi), e a reação reversa é assim a fosforólise do DNA (Fig. 2A). Para testar a eficiência desta reação reversa, investigamos a fosforólise de um primer recozido em 5′ com 32P, recozido em um fio de modelo, incubando-o com a enzima e 10 mM Pi. A figura 2C mostra a remoção do nucleotídeo terminal 3′ da fita de primer pela Taq DNA polimerase na presença de Pi e PPi, demonstrando que a Taq DNA polimerase pode sofrer a reação inversa da polimerização do DNA tanto de dNTPs como de dNDPs. A análise das polimerases termofílica Bst, Deep Vent, KOD (Fig. S4A), 9°N, Tgo e Bsu mesofílica também mostrou fosforólise de DNA (Fig. S4B), embora em menor extensão. Uma reação de controle com o fragmento de Klenow da Escherichia coli DNA polimerase I, que não aceita dNDPs como substratos, também foi examinada (Fig. S4C) e mostrou que a presença de PPi, mas não de Pi, resulta no encurtamento do primer.

Para analisar melhor a reação reversa, preparamos dsDNA rotulado internamente com 32P-fosfato, realizando uma reação de extensão do primer usando α-32P-dATP, seguida de purificação PAGE. Analisamos os produtos da reação reversa utilizando a troca aniônica (polietilenoimina) TLC. Como esperado, a incubação do DNA rotulado internamente com Taq polimerase e pirofosfato produziu produtos que se comigraram com o dATP. Reações na presença de fosfato produziram espécies migratórias mais rápidas, correspondentes ao dADP, e reações sem fosfato ou pirofosfato não produziram nenhuma espécie migratória, indicando que na presença da Taq polimerase somente o DNA permaneceu intacto (Fig. 2D) e confirmando que a reação inversa é a fosforólise do DNA.

Finalmente, a análise da cinética dependente do substrato da reação reversa revelou um KM de ∼10 ± 5 mM (n = 9) e 57 ± 5 µM (n = 5) para fosfato e pirofosfato, respectivamente, embora a baixa solubilidade do fosfato de magnésio acima de 10 mM nos tenha impedido de obter medidas precisas (Fig. 2E). As estruturas cristalinas de DNA polimerases com pirofosfato ou ácido fosfonofórmico nos locais ativos mostram uma interação Coulombic com a proteína (11⇓-13). A razão de 200 vezes entre os KMs dos dois substratos corresponde a ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) a 72 °C, uma energia de ligação aproximadamente igual a uma interação iônica entre o fosfato adicional e um cátion compensador na proteína e suportando um modelo no qual o fosfato/pirofosfato é reconhecido principalmente através de uma interação carga-carga. As estimativas das taxas máximas da reação inversa seguiram uma tendência semelhante: nestas condições, Vmax foi 0,0010 ± 0,0005 s-1 e 0,205 ± 0,005 s-1 para fosfato e pirofosfato, respectivamente, revelando novamente uma razão de cerca de 200 vezes entre as duas atividades. Tomadas em conjunto, abaixo das concentrações saturantes dos dois substratos, a reação fosfato é cerca de 4 × 104 vezes menos eficiente, sugerindo que a fosforólise do DNA não representa uma ameaça significativa à estabilidade do genoma.

Para obter mais informações sobre a síntese de DNA a partir dos substratos de baixa energia (dNDPs e Pi), medimos as energias de ativação utilizando a análise de Arrhenius das reações dianteira e reversa. Como as medidas de uma única molécula de alterações conformacionais associadas ao reconhecimento e incorporação dos dNTPs corretos revelaram um movimento protéico mais rápido do que a cinética da reação observada (14), o passo limitador da velocidade da reação dianteira na Taq polimerase está provavelmente relacionado com o passo químico ou um rearranjo pré-catalítico ativo-site que depende da interação com os fosfatos do substrato. Observamos que o Vmax das reações frente e reversa é menor para dNDP e fosfato do que para dNTP e pirofosfato, sugerindo que a etapa limitadora da taxa é sensível ao estado de fosforilação dos substratos. Entretanto, tanto o rearranjo pré-catalítico (como o alinhamento dos resíduos do local ativo e a ligação de um íon Mg2+ catalítico) quanto a etapa química podem ser afetados pela fosforilação do substrato; portanto, qualquer uma das etapas pode ser limitada na presença de dNDPs, assumindo que eles não introduzem uma nova etapa conformacional lenta no mecanismo. Em Pol β, estas duas etapas foram previamente propostas para ter constantes de taxa similares (15), e as energias de ativação calculadas para as reações frente e reversa utilizando os substratos de alta energia (dNTPs e pirofosfato) diferem em tão pouco quanto 15 kJ/mol (4). No caso das enzimas Taq termófilas e Klentaq1, a energia de ativação da reação dianteira varia muito, variando de 90 a 125 kJ/mol, dependendo das condições experimentais e provavelmente da identidade dos nucleotídeos reagentes (8, 16), enquanto a energia de ativação da pirofosforólise não foi, ao nosso conhecimento, experimentalmente determinada.

Analisamos taxas de incorporação de um único nucleotídeo de 50 µM de dCDP, dADP e dTDP, empilhados em dA, dC e dA, respectivamente, durante a reação de primer-extensão. A análise de Arrhenius mostrou uma dependência linear de ln(kobs) em 1/T para experimentos abaixo de 60 °C, revelando energias de ativação de 85 ± 14, 108 ± 11, e 112 ± 15 kJ/mol para os três nucleotídeos (Fig. 3 A e B; n = 6 para cada nucleotídeo). A análise de Arrhenius da reação reversa com fosfato de 0,4 mM, produzindo uma molécula de dADP, revelou uma grande energia de ativação de 138 ± 10 kJ/mol (n = 5), em linha com a lenta taxa observada de fosforólise de DNA por Taq (Fig. 3 A e B), e representando um aumento significativo sobre a energia de ativação calculada da pirofosforólise (92 kJ/mol em Pol β) (4). A energia de ativação das reações frente e reversa para o dADP difere assim por ∼30 kJ/mol, fornecendo um forte viés para a síntese de DNA. Esse viés para a reação dianteira resulta em uma menor necessidade de seqüestro do produto fosfato por uma via metabólica a jusante, em contraste com a síntese de DNA baseada em dNTP e a hidrólise do pirofosfato por pirofosfatases inorgânicas. Além disso, se as alterações conformacionais pré-catalíticas da Taq polimerase não forem afetadas pelos substratos de baixa energia e a etapa química for limitadora da taxa, a utilização de dNDPs e fosfatos pode produzir um novo insight experimental na catálise enzimática da síntese de DNA.

O nosso estudo demonstra que a Taq, e várias outras enzimas das famílias A e B de DNA polimerases, incluindo as enzimas replicadoras das bactérias termófilas e mesófilas, podem substituir os substratos de trifosfato canónico com os análogos de difosfato. As primeiras evidências da dispensa do γ-fosfato no substrato nucleotídico surgiram de estudos da transcriptase reversa do HIV-1 e da bacteriófago RB69 DNA polimerase gp43. As variantes de RT do HIV-1 que abolem a interação eletrostática entre o γ-fosfato do dNTP recebido e a polimerase resultaram na retenção de atividade, embora a um ritmo muito mais lento (17⇓-19), e a bacteriófago RB69 DNA polimerase gp43 exibiu atividade similar (20). Ambas as enzimas virais aceitam dNDPs como substratos, mas com KM (ou KD) que são 500 e 17 vezes maiores, e constantes de taxa que são 100 e 400 vezes menores do que para dNTPs pelo HIV-1 RT e RB69 gp43, respectivamente (20, 21). Nosso estudo demonstra que as polimerases replicadoras celulares possuem essa atividade, descreve as afinidades do substrato e as energias de ativação tanto para as reações a frente quanto para as inversas, e implica que a síntese de DNA dos dNDPs é razoavelmente eficiente, particularmente para as enzimas termoestáveis.

Nossos resultados sugerem que a replicação de DNA pode ser realizada usando os dNDPs como substratos. Em termófilos, a replicação do genoma pode ser menos sensível à carga energética da célula do que em mesófilos, porque as polimerases termoestáveis podem aceitar tanto os substratos difosforados quanto os trifosforados. A replicação de DNA é assim menos afetada pela razão ATP/ADP intracelular, e a eficiência relativamente alta com que o DNA é sintetizado a temperaturas elevadas sugere que os termófilos podem ser capazes de dispensar completamente os substratos trifosforilados. Além disso, evidências paleobiológicas sugerem que o último ancestral comum de nossa biosfera foi um termófilo (22⇓-24), e nosso estudo implica que os substratos fosforilados podem ter sido suficientes para a replicação do genoma de organismos precoces, aliviando a necessidade do metabolismo de intermediários metabólicos trifosforilados de alta energia. Em tal caso, os difosfatos poderiam ser considerados intermediários na evolução dos metabólitos de alta energia e podem incluir blocos de construção ancestrais de genomas precoces, tais como ribonucleotídeos ou ácidos nucléicos mais simples.

DNA polimerase desempenha papéis proeminentes em numerosas biotecnologias. O uso de substratos de difosfato relatado aqui tem o potencial para fazer prática a incorporação de análogos caros, como isotopicamente rotulado ou nucleotídeos quimicamente modificados, eliminando a necessidade de síntese de trifosfato desafiando. Esta característica das polimerases de DNA também pode fornecer um método para detectar nucleotídeos usados em seqüenciamento de DNA de alto rendimento. Dois métodos comuns detectam o grupo de saída de PPi associado à extensão do primer, seja através de um ensaio de quimioluminescência secundária ou pela monitorização de uma alteração no pH local (25, 26). O uso de um substrato dNDP produz Pi, oferecendo assim uma oportunidade adicional para distinguir entre nucleotídeos incorporados. Esta apreciação expandida das capacidades da DNA polimerase também sugere que o exame de outras enzimas dependentes do trifosfato poderia revelar tolerância a substratos de difosfato de menor energia e de fácil acesso como intermediários evolutivos.