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O recente editorial de Dayan e Wraith nesta revista destacou os desafios para o desenvolvimento de novas imunoterapias após o desastroso ensaio do TGN1412. Esta visão geral apresenta alguns dos conhecimentos adquiridos em muitos ensaios clínicos de anti-D que podem ser relevantes para a imunologia translacional.

Prevenção de hidrops fetalis ou doença hemolítica de Rhesus do feto e recém-nascido (HDFN) pelo anti-D profilático é a aplicação clínica mais bem sucedida da imunossupressão mediada por anticorpos. A HDFN ocorre após uma mulher D-negativa se imunizar contra os eritrócitos fetais D-positivos após hemorragia fetal; o anti-D IgG produzido é transferido através da placenta causando a destruição dos eritrócitos fetais pelos macrófagos esplénicos. Na década de 40, quando a causa desta doença foi reconhecida pela primeira vez, 1% dos bebés nasceram com HDFN e 40% deles morreram. O anti-D é o anticorpo mais comum implicado. O polipéptido RhD nos glóbulos vermelhos é o mais imunogênico dos antígenos do grupo sanguíneo, pois está ausente das células de indivíduos D-negativos que não possuem o gene RHD .

HDFN é agora raro, em parte devido à melhoria dos cuidados fetal e neonatal, mas principalmente devido à prevenção da imunização primária de mulheres D-negativas susceptíveis por IgG profilática anti-D . Desde 1968, após ensaios clínicos bem sucedidos no Reino Unido e nos EUA, o anti-D tem sido administrado a 10% de todas as mulheres pós-natal, resultando numa redução da incidência da doença de cerca de 95%. Menos de 30 mortes perinatais por ano são agora causadas por HDFN. Em 2002, o Instituto Nacional de Saúde e Excelência Clínica (NICE) recomendou que a profilaxia antenatal de rotina anti-D fosse administrada a todas as mulheres D-negativas, além da profilaxia pós-natal, para reduzir ainda mais a taxa de imunização. O anti-D intravenoso (IV) também é agora utilizado terapêuticamente para tratar alguns pacientes D-positivos com púrpura trombocitopénica imune (PPI). Assim, a demanda por anti-D está aumentando.

A imunoglobulina Anti-D é preparada a partir de plasma humano hiperimune agrupado. Por muitos anos, questões sobre segurança virológica e, mais recentemente, a variante da doença de Creutzfeld Jacob (vCJD) têm estimulado a busca por suprimentos alternativos. No Reino Unido, o plasma para fracionamento é agora obtido de doadores norte-americanos devido à preocupação com o fato de os doadores britânicos serem portadores latentes da vCJD. Com o objetivo de substituir o anti-D policlonal preparado a partir de plasma humano por versões biotecnológicas para uso diagnóstico e clínico, centenas de anticorpos anti-D monoclonais (mAb) ou recombinantes (rAb) foram produzidos. Todos eles são derivados de genes da imunoglobulina humana ou células B porque os ratos não reconhecem o antígeno RhD. Vários sistemas de expressão têm sido utilizados, incluindo linhas de células B humanas, células do ovário de hamster chinês (CHO), heteroidbridomas humanos de rato e mielomas de rato.

Embora o mecanismo exacto de supressão da imunização D através da administração de IgG passivo anti-D ainda não tenha sido elucidado, sabe-se que as células vermelhas D-positivas são rapidamente removidas para o baço pelos macrófagos através das interacções do receptor IgG Fc (FcγR) e tornadas não-imunogénicas. Na verdade, para garantir que o anti-D profilático seja eficaz na prevenção da imunização D para uma grande FMH, as mulheres são testadas 2-3 dias depois para verificar se as células fetais são limpas da circulação. Caso contrário, os glóbulos vermelhos alogénicos têm uma longa sobrevivência após FMH ou transfusão. As respostas aloimunes são lentas a desenvolver, normalmente 5-15 semanas para o anti-D . Isto é provavelmente devido à sua falta de sinais de perigo (de moléculas estranhas) de modo que não são reconhecidas pelo sistema imunológico até ficarem senescentes, o que então estimula a sua fagocitose via receptores de serina de fosfatidil. Sem a profilaxia de RhD, aproximadamente 17% das mulheres D-negativas ficam imunizadas após a gravidez com um feto D-positivo. Esta incidência é menor do que para sujeitos normais deliberadamente imunizados (até aproximadamente 85% respondem) porque para a maioria das mulheres os volumes de FMH são muito pequenos para que os eritrócitos sejam imunogénicos . Mulheres grávidas podem fazer respostas aloimunes robustas enquanto toleram seu feto semi-alogênico.

Nos últimos 20 anos, 19 anti-D mAbs e rAbs foram testados em 15 estudos de primeiros socorros. Estes foram revistos recentemente e estão aqui resumidos. Não ocorreram efeitos adversos graves. Os ensaios biológicos in vitro de fagocitose e hemólise mediados por FcγR usando células efetoras humanas estão bem estabelecidos e foram usados para triagem. Os ensaios clínicos avaliaram a capacidade dos anticorpos para remover pequenos volumes (menos de 1%) de eritrócitos D-positivos da circulação e em alguns estudos a capacidade do anti-D para prevenir a imunização D também foi então determinada. Muitos dos mAbs e rAbs foram directamente comparados com o anti-D.

Foi observada uma grande heterogeneidade na eficácia dos anticorpos (Tabela 1). Dois mAbs derivados de linhas de células linfoblastóides B humanas, BRAD-3 e BRAD-5, mediaram a rápida depuração dos eritrócitos e impediram a imunização D quase tão eficazmente como o anti-D policlonal, embora tenha sido utilizada uma dose três a quatro vezes maior. A semi-vida plasmática de BRAD-3 e BRAD-5 foi normal, mas a biodisponibilidade foi metade da do anti-D policlonal. Quando esses anticorpos foram expressos como rAbs em células CHO, a eliminação de células vermelhas autólogas D-positivas foi mais lenta do que os mAbs originais . Um grande estudo utilizando outro anti-D rAb derivado de CHO, MonoRho, deu resultados decepcionantes, sendo a depuração de eritrócitos extremamente variável, geralmente muito lenta e sem correlação com a dose de anti-D . A biodisponibilidade muito baixa do MonoRho pode explicar em parte isso. Os sujeitos, no entanto, não produziram anti-D, embora não lhes tenham sido dadas injecções de desafio de eritrócitos D-positivos para determinar o seu estado de imunização D . Os MAbs produzidos pelas linhas de células do mieloma murino (como heterohibridomas humanos de rato) também mostraram uma grande variabilidade na eliminação de eritrócitos, mas inesperadamente, mais de metade dos receptores rapidamente se imunizaram com D, o dobro do que aconteceria apenas com os eritrócitos. Assim, estes anti-D tiveram um efeito adjuvante, melhorando a resposta imunológica aos eritrócitos D-positivos em vez de a prevenir como pretendido. Estudos posteriores utilizando anti-D rAbs produzidos por células do mieloma de rato mostraram que eles promoviam uma eliminação extremamente rápida dos eritrócitos autólogos, mais rapidamente do que o anti-D policlonal. O efeito de alterar a linha celular que expressa o FOG-1 do rato para o rato foi impressionante, alterando a depuração de muito lenta e incompleta para muito rápida . Neste último estudo, isso foi associado à hemólise, algum clearance para o fígado e reações febris. Estas respostas não ocorrem após a profilaxia com anti-D policlonal. Inesperadamente, mutantes do FOG-1 rAb, que não tiveram interações in vitro FcγR, também mediaram a rápida depuração dos eritrócitos, embora a sobrevida normal tivesse sido esperada. Estes anti-D IgG devem ter sido ligados a receptores diferentes do IgG FcγR.

Muitos dos anti-D mAbs e rAbs não se comportaram como anti-D policlonal. Nenhum foi tão eficaz e alguns das linhas de células roedoras até resultaram em respostas imunes indesejáveis. As respostas in vivo foram determinadas principalmente pelas espécies de linhas celulares que produzem os anticorpos e não pelas sequências de proteínas. A causa destas reacções inesperadas e possivelmente prejudiciais pode ser porque o anti-D IgG produzido a partir de células animais interagiu com componentes do sistema imunitário inato. A explicação mais provável é a variação na sua composição oligossacarídeo.

O tipo de glicosilação da IgG depende da célula em que é produzida e é específica da espécie. Estruturas como o ácido N-glicólico neuramínico e oligossacarídeos de manose alta em IgG roedor podem ser reconhecidos como estranhos por receptores de reconhecimento de padrão imune inato (PRRs) com subsequentes respostas pró-inflamatórias. Os PRRs incluem receptores celulares de asialoglicoproteína e manose. Depois de ligar o anti-D nos eritrócitos D-positivos, eles podem ter estimulado respostas de anticorpos ao antígeno D. No plasma, a lectina de ligação de manan pode causar hemólise complementar mediada quando ligada aos resíduos de manose do anti-D em um eritrócito. Os anticorpos IgG endógenos que reconhecem galactose-α1,3-galactose na IgG murina podem ligar o anti-D expressando este oligossacarídeo. Recentemente, o anti-galactose-α1,3-galactose da IgE endógena causou reacções de hipersensibilidade em alguns doentes ao cetuximab (um imunoterapêutico contra o cancro) produzido nas células do mieloma SP2/0 do rato. A falta de ácido siálico em muitos anti-D mAbs e rAbs tornaria o IgG pró-inflamatório após a ligação FcγR .

Anti-D policlonal pode ser benéfico ou letal em diferentes cenários clínicos. A dose de eritrócitos alvo é um fator importante. A liberação de pequenos volumes de eritrócitos, como na FMH, é um processo ‘silencioso’, não-inflamatório e não hemolítico. Se, no entanto, um indivíduo D-positivo recebe grandes doses de anti-D, como em um feto que sofre de doença hemolítica RhD ou, raramente, pacientes PTI tratados com anti-D intravenoso, pode ocorrer hemólise grave. Nestes casos ocasionalmente fatais, sintomas adicionais são geralmente hidropisia (edema) na HDFN e hemoglobinemia aguda, hemoglobinúria e coagulação intravascular disseminada em pacientes com PTI. A maioria dos casos de hemólise aguda foi considerada como sendo devida a hemólise extravascular robusta (mediada por macrófagos) e não a hemólise intravascular. Mesmo na ausência de tais eventos adversos graves, os pacientes com PTI não raras vezes apresentam febre e calafrios após infusão de anti-D intravenoso, indicativo de reações inflamatórias. Assim, se os pacientes de ITP fossem tratados com anti-D mAbs pró-inflamatórios ou rAbs em vez do atual anti-D policlonal, uma série complexa de reações não intencionais e potencialmente perigosas poderia seguir.

Na sequência do estudo TGN1412 fase 1, alguns aspectos dos ensaios clínicos de anti-D podem ser úteis para o desenvolvimento e regulação futura de estudos de primeiros socorros de outros imunoterapêuticos, especialmente os que visam células no sangue (Tabela 2). A escolha da dose inicial é particularmente importante. Foram utilizadas doses baixas de eritrócitos e anti-D em todo o trabalho em humanos. Em alguns estudos, por exemplo para BRAD-3 , os glóbulos vermelhos autólogos (0-5 ml) foram revestidos com anti-D ex vivo, depois lavados e injetados, minimizando assim a dose de anticorpos e atenuando a possibilidade de efeitos adversos. A liberação de tão pequenos volumes de eritrócitos pôde ser seguida com precisão quando foram rotulados isotopicamente. Quando este anticorpo se mostrou seguro e eficaz, os anti-D e os eritrócitos foram então injectados separadamente para simular mais de perto a situação clínica. Evidências de reações inflamatórias com baixas doses de anti-D e eritrócitos devem garantir cautela nos estudos de aumento de escala.

Em conclusão, Os extensos dados de estudos humanos de anti-D mAbs e rAbs sugerem que sua glicosilação pode ter tido um efeito poderoso na modulação de suas atividades in vivo. Alguns rAbs aumentaram em vez de diminuir a incidência de imunização D, um causou reações hemolíticas prejudiciais e outro teve uma biodisponibilidade extremamente baixa. Estes efeitos não foram previstos a partir dos estudos in vitro realizados. No futuro, ao desenvolver glicoproteínas recombinantes para terapia humana, deve-se considerar a possibilidade de que interações entre oligossacarídeos não humanos e células ou moléculas que não o ligante pretendido possam ocorrer.