O cnidosaco em Cladobranquia
Anatomia comparativa do cnidosaco
Principais para o presente estudo, numerosas suposições têm sido feitas sobre a uniformidade da morfologia do cnidosaco entre os cladobranquioses que abrigam cleptocnídeos . Edmunds em particular fornece desenhos que são notavelmente consistentes entre as espécies de Fionidae, Favorinidae, Facelinidae e Aeolidiidae, embora as descrições do cnidosac não tenham sido o objetivo principal daquela publicação. Todas as espécies ilustradas nesse trabalho possuem uma entrada clara ligando a glândula digestiva ao cnidosac (embora em alguns casos seja representado um ligeiro alongamento da entrada, semelhante a um canal) e uma saída distinta na ponta das ceras ligando o cnidosac ao exterior. Além disso, todos os cnidosacos são retratados para possuir cleptocnídeos, e a forma como a musculatura é apresentada é também muito uniforme. O estudo mais detalhado sobre o cnidosacs aeolid, até agora, foi escrito por Kälker e Schmekel , mas não descreveu suficientemente a variação que pode ser encontrada nesta estrutura nas cerca de 600 espécies de aeolids . Além disso, os trabalhos sobre as estruturas semelhantes ao cnidosac em Hancockia spp. começaram apenas recentemente .
Neste estudo, descobrimos que o comprimento, tamanho e estrutura da entrada do cnidosac varia mais do que o esperado com base em trabalhos anteriores, assim como a estrutura da saída, ou cnidopore, a musculatura que envolve o cnidosac, e a posição e orientação dos cleptocnídeos . É importante notar que, embora forneçamos ampla amostragem de taxon de caracteres morfológicos do cnidosac, para muitas espécies apenas um espécime estava disponível para análise. Como tal, as observações de ausência em certos casos devem ser tomadas com cautela. Discutimos esses táxons em particular abaixo.
O trabalho anterior apresenta apenas uma entrada curta e simples no cnidosac (ou seja, uma abertura direta) , provavelmente devido à seleção de táxons que possuem essa condição simplesmente por acaso. O nosso trabalho sugere que esta é a transição mais comum entre a glândula digestiva e o cnidosaco. No entanto, Hancock e Embleton mencionam a presença de um canal ciliado em Aeolidia (= Eolis) papillosa e Herdman e Clubb notam a presença de um “canal de ligação longo e curvo” no que é agora Facelina bostoniensis (= Facelina drummondi). Alguns taxa possuem um canal ciliado, incluindo Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina, e Paraflabellina ischitana . Estes táxons não estão intimamente relacionados, e portanto o canal não é homólogo entre os táxons que o possuem, sugerindo uma explicação funcional para sua presença. Inicialmente suspeitámos que a presença deste canal alongado estava relacionada com o tamanho dos cleptocnídeos, como A. papillosa, C. amboinensis, e P. ianthina todos seqüestram cleptocnídeos maiores (> 20 μm de comprimento). Entretanto, isto não é suportado por C. peregrina e P. ischitana, pois estas espécies seqüestram nematocistos menores. Nestes casos, o canal ciliado pode ser uma relíquia de uma mudança ancestral na dieta, mas o possível significado funcional do canal ciliado permanece especulativo.
Simplesmente, não há um padrão consistente entre os taxa que possuem uma zona de proliferação versus os que não possuem. A única exceção é a ausência de uma zona de proliferação nos taxa que não seqüestram nematocistos do gênero Phyllodesmium. A única espécie dentro do Phyllodesmium na qual identificamos uma zona de proliferação é P. jakobsenae, que é a única espécie de Phyllodesmium conhecida por abrigar cleptocnides. Ainda não está claro porque alguns taxa parecem ter uma zona de proliferação enquanto outros não, mas suspeitamos que num pequeno número de casos artefactos da secção de algumas amostras levaram à destruição desta região (provavelmente devido a dificuldades de preservação), o que leva a fragmentos de membrana e cleptocnídeos flutuantes livres dentro dos cnidosacs de algumas espécies a (por exemplo, Cratena peregrina; Fig. 4d). Para abordar este ponto, mais indivíduos destas espécies devem ser investigados. A aparente ausência de uma zona de proliferação também pode ser devida a diferenças no estágio de crescimento dos indivíduos investigados, ou dos cerata se algum estivesse em processo de regeneração, mas não encontramos evidências que apóiem explicitamente qualquer uma destas hipóteses. Além disso, pelo menos um estudo anterior mencionou a presença desta região, mas não foi discutida em detalhes. Esta região é onde os nematocistos são tomados pelos cnidófagos antes de migrarem para a extremidade distal do cnidosac. No entanto, a extensão exacta da zona de proliferação permanece pouco clara. Em algumas espécies, parece estar restrita ao cnidosaco (por exemplo, Pteraeolidia ianthina; Fig. 4a), mas em outras esta zona parece estender-se para as partes adjacentes da glândula digestiva (por exemplo, Dondice occidentalis; Fig. 4b). Na maioria dos taxa que seqüestram nematocistos, encontramos apenas saídas muito simples do cnidosac, que em alguns casos é coberto por um fino epitélio. Esta cobertura contém células semelhantes à da epiderme do cerata, que é composta por células colunares alongadas com o que parecem ser muitos vacúolos especializados. As saídas simples são as mais comuns, tanto em nosso estudo como aparentemente em outros. No entanto, em alguns taxa selecionados dentro de Aeolidiidae, incluindo Aeolidia papillosa, Anteaeolidiella chromosoma e Cerberilla amboinensis, um cnidopore complexo está presente (Fig. 4c). Apresenta um revestimento epitelial que aparece contínuo com o da epiderme. Esta estrutura já foi identificada antes, mas foi simplesmente considerada uma zona de células indiferenciadas que se acreditava servir de reserva para cnidófagos perdidos. Entretanto, devido à localização na extremidade distal do cnidosac, e como parte do cnidopore, suspeitamos que não seja este o caso. Em vez disso, nós colocamos a hipótese de que esta camada celular é uma adaptação especial para liberar os excepcionalmente longos e estreitos nematocistos sequestrados de anêmonas (até 50-60 μm em comprimento, mas < 5 μm em largura). O termo cnidopore foi usado anteriormente sem crítica para se referir a todas as saídas do cnidosac , mas agora redefinimos aqui o termo cnidopore para se referir à estrutura até agora apenas encontrada em Aeolidiidae.
Embora a musculatura que envolve o cnidosac também varie em Aeolidida, o significado desta variação não é claro. A musculatura ao redor do cnidosac é muito fina ou carente apenas em algumas espécies, incluindo Embletonia gracilis, Embletonia pulchra e Bulbaeolidia alba. Quando presente, a espessura muscular varia entre as espécies, desde o que parece ser de uma até múltiplas camadas. Esta variação na espessura da musculatura é ilustrada em um estudo anterior, embora não tão precisa quanto indicamos aqui (Tabela 3). Não há uma explicação evolutiva óbvia para a variação da espessura do músculo ou do número de camadas musculares através dos táxons, mas uma camada muscular mais espessa provavelmente resultaria numa expulsão mais vigorosa das cleptófonias. O aumento da musculatura pode estar associado à pressão de predação, tamanho dos cleptógenos incorporados, ou estágio de desenvolvimento. Incorporar indivíduos adicionais de cada espécie, e em diferentes estágios de desenvolvimento, bem como medidas do tamanho do cleptógeno e espessura muscular seria benéfico para avaliar estas hipóteses.
A diferenciação dos cnidófagos de uma célula funcional e ativa em um “recipiente ou despensa” de cleptógenos na ponta do cnidosac reflete a maturação dos cleptógenos via transporte de prótons, que são imaturos e não-funcionais quando seqüestrados pela primeira vez. Após o amadurecimento, as células parecem não ter mais nenhum funcionamento devido à redução da complexidade celular. Trabalhadores anteriores tentaram abordar a origem da membrana do cnidófago, e recentemente concluíram que é um fagosoma, uma vesícula especializada formada pela membrana celular. Dentro dos cnidófagos, o número de cleptógenos pode variar tanto dentro como entre os taxa. Isto parece estar associado com o tamanho dos cleptógenos; tende a haver menos cleptógenos grandes (> 20 μm de comprimento) dentro de um determinado cnidófago em comparação com aqueles com cleptógenos menores (geralmente 10 μm ou menos). Um exemplo pode ser encontrado em Pteraeolidia ianthina (Fig. 4a), que seqüestra nematocistos de múltiplas classes de tamanho.
Divergências do tema geral
Os caracteres morfológicos avaliados neste estudo parecem ser bastante variáveis dentro das famílias, mas a maioria dos cnidosacs geralmente variam sobre um tema que é conservado em Aeolidida. No entanto, há ainda outros que perderam estruturas particulares do cnidosac ou que perderam o cnidosac por completo. Pode-se supor que os cnidosacos perdem a conexão com a glândula digestiva ou a musculatura que envolve o cnidosaco quando nenhum nematocisto é sequestrado. Por exemplo, espécies do gênero Phyllodesmium (com exceção de P. jakobsenae) possuem cnidosacs ligados a músculos que parecem ser desprovidos de cleptocnídeos, mas não há entradas óbvias para o divertículo digestivo ou saídas para o ambiente externo. Pelo contrário, estas espécies sequestram produtos químicos para defesa, não necessitando, portanto, de uma entrada estruturada. Desta forma, os cnidosacs em Phyllodesmium podem ser semelhantes às formações dérmicas do manto em Charcotiidae, que carecem de uma saída mas liberam conteúdo quando comprimidos. Entretanto, em espécies do gênero Favorinus, a estrutura geral do cnidosaco (incluindo a abertura da glândula digestiva e dos músculos ao redor do cnidosaco) permanece a mesma, mas nenhum cleptógeno está presente devido à propensão destas espécies para se alimentarem de ovos de outros gastrópodes. Embora seja possível que a falta de cleptocnídeos possa derivar de uma hipotética propensão em Phyllodesmium e Favorinus para descarregar nematocistos durante o processo de fixação, sugerimos que isto seja improvável. Para um, os membros do Phyllodesmium parecem ter um epitélio intacto onde se poderia esperar que os cleptocistos fossem expulsos. Se os cleptógenos fossem ejectados durante a fixação, as ceras seriam fixadas com uma abertura na ponta. Além disso, a ausência de cleptógenos em Phyllodesmium em particular também está bem documentada (com excepção de P. jakobsenae) . Em Favorinus, é possível que este seja o caso, dado o epitélio aberto na ponta do cerata (por exemplo, Fig. 2c), mas a ausência de cleptocnídeos é consistente com o hábito de membros deste gênero comerem ovos gastrópodes.
Even mais variações sobre este tema são encontradas em Bulbaeolidia alba, Embletonia spp., e espécies dentro do gênero Fiona. Bulbaeolidia alba tem um saco na extremidade distal da glândula digestiva que contém apenas zooxanthellae (Symbiodinium) ocasional. Além disso, não encontramos nenhuma entrada ou saída óbvia para ou do saco, e a estrutura parece estar rodeada por algumas fibras musculares finas. Hipotecamos que a falta de cleptocnídeos pode ser devida ao tamanho muito pequeno da B. alba, que pode, portanto, possuir uma menor necessidade de defesa, mas ainda menores taxas dentro dos gêneros Embletonia e Pseudovermise possuem cleptocnídeos. Alternativamente, podemos supor que a falta de sequestro pode estar relacionada com o tamanho ou utilidade dos nematocistos encontrados dentro das anémonas das quais esta espécie se alimenta. Uma terceira alternativa é que B. alba aloja outros compostos naturais dentro deste saco, seja de suas presas como no Phyllodesmium ou produzidos de novo. Novamente, é possível que a falta de cleptocistos em B. alba seja um artefato de tamanho pequeno, mas como no Phyllodesmium, nenhuma evidência de extrusão pôde ser encontrada. Membros de Embletoniidae parecem ter perdido evolutivamente a musculatura em torno do cnidosac inteiramente ou representam um passo intermediário na evolução do cnidosac, como discutido na seção de evolução do cnidosac abaixo. Também não há nenhuma entrada ou saída óbvia de e para o cnidosac nestes taxa. Finalmente, algumas espécies de Fionidae dentro do gênero Fiona (este estudo) perderam completamente os cnidosacs, aparentemente porque as espécies deste gênero preferem presas não-canidianas .
Nematocistos sequestrados também foram encontrados em uma outra família dentro de Cladobranchia, Hancockiidae. Vemos estruturas em Hancockia californica que são muito semelhantes aos cnidosacs (que chamamos cnidosac), com cleptocnídeos alojados em células semelhantes a cnidófagos em múltiplos sacos musculares na ponta de cada ceras. Estas estruturas também foram encontradas em Hancockia uncinata e H. schoeferti , e em alguns casos estruturas semelhantes ao cnidosaco foram encontradas tanto na cerata como nas bainhas rinoforais. As inferências homológicas sobre as estruturas encontradas em Hancockiidae e em Aeolidida são discutidas na próxima seção.
Filogênese de Cladobranquia e evolução do cnidosac
Inferências filogenéticas
Dado que muitos dos dados moleculares aqui incluídos são derivados de estudos publicados anteriormente, a topologia inferida em nossa análise filogenética (Figura 5) é consistente com a encontrada em ambos estudos filogenéticos recentes. Entretanto, este trabalho estende os achados anteriores, incluindo táxons não analisados em estudos filogenômicos recentes, a saber, táxons dos gêneros Phyllodesmium, Caloria, Pruvotfolia, Pteraeolidia, Cratena, Facelina, Glaucus, Calmella, Piseinotecus, Tergipes, Notaeolidia, Embletonia e Charcotia. A maioria delas se enquadra nos clades que esperaríamos com base em trabalhos moleculares anteriores: Phyllodesmium está intimamente relacionado com Dondice dentro do clade facelinídeo que é irmã de Aeolidiidae ; Caloria é apoiada dentro do clade da segunda facelinídeo e está intimamente relacionada com espécies de Pruvotfolia ; Facelina, Glaucus e Cratena estão intimamente relacionados dentro do clade da segunda facelinídeo ; Calmella está intimamente relacionada com Flabellina e Paraflabellina ; e Tergipes está dentro do que é agora Fionidae . No entanto, a colocação de Pteraeolidia como estreitamente relacionada com Palisa e Austraeolis dentro do clade da segunda facelinídea é novidade para este estudo, e os dados moleculares aqui apresentados apoiam a posição de Charcotia dentro do grupo irmão para Aeolidida, como sugerido anteriormente pelo trabalho morfológico .
Embora todos os novos dados aqui apresentados sejam adicionados, as posições de Notaeolidia e Embletonia permanecem pouco claras . O suporte para as posições exatas destes dois gêneros é pobre, e estes táxons parecem contribuir para os baixos valores de bootstrap na base de Aeolidida. Isto pode ser devido à atração de longo curso entre Notaeolidia e Flabellinopsis iodinea , e entre Embletonia e Unidentia. Contudo, as análises morfológicas também suportam pelo menos a divergência anterior da Notaeolidia dentro da Aeolidida . A incerteza em torno das afinidades destes quatro taxa tem implicações para a nossa compreensão da evolução do cnidosac.
Nós também descobrimos que as análises individuais de árvores de genes (e a análise dos três genes) são consistentes com as análises de sequências anteriores baseadas em PCR em larga escala. Estas topologias e probabilidades posteriores suportam a ideia de que os dados sequenciais baseados em PCR para os genes utilizados (COI, 16S e 18S) fornecem alguma utilidade para inferir divergências recentes, mas que os dados sequenciais de alto rendimento são necessários para inferir divergências mais profundas.
Cnidosac evolution
A sequestração de nematocistos cnidários teve origem pelo menos duas vezes dentro de Cladobranchia com base na filogenia aqui apresentada (Fig. 6). Este resultado também indica que espécies dentro da Aeolidida que não seqüestram nematocistos perderam esta habilidade, o que parece ter ocorrido pelo menos três vezes. Além disso, a divergência precoce do Embletoniidae dentro da filogenia de aeolidida é sugestiva; indica que a estrutura dentro do Embletoniidae é um cnidosac, e que a falta de musculatura ao redor do cnidosac pode representar um passo intermediário na evolução do seqüestro de cleptocnídeos. No entanto, um suporte mais forte para as relações na base do Aeolidida é necessário antes que se possam fazer mais inferências. Nossos resultados também suportam várias perdas independentes do cnidosac, inclusive em membros da Fiona e da Tergipes. Isto parece ser devido a uma mudança para a predação principalmente em Crustáceos na Fiona. Uma transição de preferência de presas de hidroides para outros tipos de organismos pode também ter levado à perda de cnidosacos em algumas espécies de Tergipes .
A presença de um saco na extremidade distal da glândula digestiva é uma hipótese de ter se originado antes da capacidade de seqüestrar nematocistos (Figura 6; caixa cinza), embora este resultado se baseie na hipótese de que os sacos terminais encontrados em Charcotiidae e Proctonotidae são homólogos aos de Aeolidida. O suporte para esta hipótese é muito baixo, e portanto parece improvável com base na nossa reconstrução. Entretanto, os sacos terminais de Charcotiidae e Proctonotidae são considerados como estruturas excretoras, e alguns têm a hipótese de que o aeolidida cnidosac é uma adaptação deste saco para defesa. Embora a homologia permaneça incerta, nossa reconstrução do estado ancestral não rejeita completamente esta hipótese de modificação, na qual o saco distal foi exaptado para seqüestrar nematocistos. Mais dados morfológicos e moleculares de espécies adicionais no clade Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidae são necessários para testar mais esta hipótese, pois este clade não está bem representado em nossa análise, o que pode dificultar inferências evolutivas.
As estruturas semelhantes ao cnidosac em Hancockiidae parecem ter evoluído independentemente do saco distal tanto no clade Aeolidida como em seu clade irmão. Isto é apoiado pelas análises filogenéticas aqui apresentadas, assim como diferenças no processo de sequestro entre Hancockia e espécies de aeolidida. Por exemplo, parece que as espécies de Hancockia encapsulam nematocistos no lúmen do trato digestivo antes do transporte, ao contrário das aeolididas.