Frontiers in Chemistry

Introduction

Biodiesel é um combustível biodegradável e renovável produzido por transesterificação a partir de fontes renováveis como soja, microalgas, óleo de cozinha de palma e pinhão manso (da Silva César et al., 2018; Corach et al., 2019). Recentemente, o biodiesel está atraindo muitos pesquisadores, pois é um dos biocombustíveis mais explorados que poderiam reduzir a dependência global dos combustíveis fósseis e o efeito estufa. Estima-se que a produção de biodiesel aumente anualmente 4,5% e atinja 41 Mm3 em 2022 (Monteiro et al., 2018).

A glicerol de ruta é o principal subproduto produzido durante o processo de transesterificação na planta de biodiesel, com a geração de 10 wt.% do produto biodiesel (Samul et al., 2014). Com base na análise, cerca de 1 kg de glicerol bruto é gerado a cada 10 kg de produção de biodiesel (Hajek e Skopal, 2010; Tan et al., 2013; Chol et al., 2018). O valor atual de mercado do glicerol puro é de US$ 0,27-0,41 por libra; entretanto, o glicerol bruto com 80% de pureza é tão baixo quanto US$ 0,04-0,09 por libra. Isto provou que a produção excessiva de glicerol, afeta o preço do glicerol no mercado. Portanto, a utilização do glicerol bruto para produtos de valor agregado tornou-se um problema sério na indústria do biodiesel.

O glicerol com alta pureza tem uma ampla aplicação em várias indústrias, tais como farmacêutica, cosmética e de produtos alimentícios. Contudo, a percentagem de pureza do glicerol da indústria do biodiesel está a limitar a sua conversão para um produto de alto valor (Samul et al., 2014; Talebian-Kiakalaieh et al., 2018). O glicerol bruto contém um grande número de contaminantes como sabão, sais, etanol, metanol, água, ácido graxo, ésteres metílicos, glicerídeos e cinzas (Tan et al., 2013; Dhabhai et al., 2016). Yang et al. (2012) afirmaram que as impurezas no glicerol bruto poderiam influenciar grandemente sua conversão em outros produtos de valor agregado (Yang et al., 2012). Venkataramanan et al. (2012) também relataram que os sabões no glicerol bruto têm um forte efeito inibidor sobre a utilização do glicerol por bactérias, o que afeta o desempenho do glicerol bruto como fonte de carbono no processo de fermentação (Venkataramanan et al., 2012). Como conclusão, as impurezas presentes no glicerol bruto criam um desafio significativo para convertê-las em um produto de valor agregado. Portanto, é importante purificar a glicerina bruta para evitar a saturação do mercado e aumentar os lucros da produção de biodiesel.

Na literatura, os processos mais comumente utilizados são destilação, resina de troca iônica, tecnologia de separação por membranas, acidificação, seguida de neutralização e extração por solventes. A acidificação é uma técnica comumente utilizada para neutralizar as impurezas como catalisador em sal inorgânico. Além da acidificação, ela também é capaz de reduzir a quantidade de sabões, convertendo-os em ácido graxo livre insolúvel, uma vez que podem ter um impacto negativo na separação e causar perda de rendimento (Hajek e Skopal, 2010; Kovács et al., 2012). Uma vez que o processo de acidificação não remove todas as impurezas, é necessário um passo adicional de purificação para remover outras impurezas como metanol, óleo, água e éster. No entanto, o processo de destilação tem alguma limitação em relação a outros, uma vez que requer alta energia para a vaporização e causa decomposições térmicas (Lancrenon e Fedders, 2008). Além disso, o alto vácuo também é necessário na destilação para evitar a desnaturação a alta temperatura do glicerol através da formação de acroleína (Manosak et al., 2011). Além disso, este processo envolve alto investimento de capital e custo de manutenção, acompanhado de perdas consideráveis de glicerol (Sdrula, 2010). Em comparação com o processo de destilação, o processo de troca iônica está ganhando ampla aceitação devido à simplicidade de operação, baixo consumo de energia e necessidade energética, bem como pelo fato de ter se mostrado também eficiente na remoção de traços de impurezas, cor e odor (Carmona et al., 2009, 2012). Além disso, Xiao et al. (2013) sugeriram que o processo de purificação em múltiplas etapas do glicerol bruto poderia aumentar a pureza tornando-o viável para vários usos (Xiao et al., 2013).

Este estudo tem como objetivo obter glicerol bruto com a maior pureza através da purificação em duas etapas utilizando técnicas de acidificação e troca iônica, com o auxílio do método Taguchi. Neste estudo, foram utilizadas análises estatísticas, incluindo uma matriz ortogonal L9 de Taguchi, relação sinal-ruído, análise de média, análise de variância e análises de regressão para identificar as condições ótimas dos processos de purificação.

Materiais, Químicos e Métodos

Materiais

A glicerina bruta foi coletada de uma planta de biodiesel local, na Malásia. Uma resina de troca catiônica forte H+, Amberlyst 15 foi comprada da Sigma Aldrich Sdn. Bhd. As propriedades da resina são mostradas na Tabela 1. Ácido fosfórico (85 wt.%), pellets de hidróxido de sódio e metanol foram comprados da Merck Sdn. Bhd. Foi utilizada água destilada para a preparação de soluções químicas.

Processo de purificação de glicerol

Primeiro Passo: Acidificação

O glicerol bruto foi pré-tratado com base no procedimento adoptado por Manosak et al. (2011). Os experimentos foram conduzidos nos frascos de Erlenmeyer de 500 ml e equilibrados utilizando um agitador magnético. Inicialmente, a glicerina bruta foi acidificada usando ácido fosfórico até o valor de pH desejado e depois agitada a uma taxa constante de 200 rpm durante 1 h. A solução foi então deixada ociosa para a separação de fases. Ela foi separada em três camadas, que são uma camada livre de ácido graxo, glicerol e sal inorgânico, respectivamente. A primeira camada, que é rica em ácido gordo, foi separada por decantação, e o sal precipitado foi removido por filtração utilizando filtro 0,45 μm. A camada média, que é rica em glicerol, foi neutralizada (pH 7) pela adição de NaOH. Os sais inorgânicos e ácidos graxos que se formaram na fase de neutralização foram removidos por meio do filtro 0,45 μm. Os parâmetros de entrada selecionados para este desenho foram pH, temperatura e tempo de reação, que foram designados como parâmetros A, B, e C, respectivamente (Tabela 2). A matriz ortogonal L9 foi usada para projetar os experimentos neste trabalho (Tabela 3).

Segundo Passo: Troca iônica

No processo de troca iônica, foi utilizado o glicerol pré-tratado obtido do processo de acidificação com condições operacionais otimizadas. As resinas de troca iônica foram investigadas passando a alimentação através de uma coluna de 300 ml de resina suportada em um tubo de vidro. As resinas de permuta iónica do tipo Amberlyst 15 forma de hidrogénio foram utilizadas para a remoção livre de iões. A resina foi previamente inchada com metanol (25 wt.%) em um recipiente de vidro e embalada na coluna. Além disso, as contas de sílica também foram embaladas dentro da coluna para remover o excesso de umidade. As resinas de troca iónica foram utilizadas para adsorver os ânions e catiões livres no glicerol pré-tratado. O glicerol pré-tratado foi então carregado no tanque de alimentação, e uma bomba foi usada para fazer circular o glicerol bruto através do leito de resina de troca iônica nas condições de operação pré-determinadas. A temperatura do leito fixo foi estabelecida à temperatura ambiente (22°C). Em seguida, a amostra foi colocada no evaporador rotativo para o processo de remoção do metanol. Os efluentes foram coletados e analisados. Os parâmetros de entrada selecionados para este projeto foram a quantidade de resina, a vazão e a quantidade de solventes. Uma matriz ortogonal padrão L9 (OA) foi selecionada, e nove estudos experimentais foram realizados para otimizar o processo. A matriz ortogonal L9 destina-se a compreender o efeito de fatores independentes, cada um com valores de nível de 3 fatores. O desenho experimental dos experimentos Taguchi sugere a matriz ortogonal L9, onde nove experimentos são suficientes para otimizar os parâmetros. Cada parâmetro em três níveis para este estudo é mostrado na Tabela 4. A Tabela 5 mostra as execuções experimentais com diferentes combinações de parâmetros em diferentes níveis.

Métodos Analíticos

Cromatografia gasosa (GC) do gel 6890 acoplado com um detector de ionização de chama (FID) foi usado para identificar a concentração de glicerol sob as seguintes condições: (i) coluna capilar (DB 5HT), 0,32 mm de diâmetro interno, 15 m de comprimento com 0,1 μm de filme líquido, (ii) hélio de gás portador a 1,0 mL/min, e (iii) temperatura do injetor 200°C, e (iv) tempo total de funcionamento de 5 min. O teor de água de glicerol foi medido utilizando o titrador Karl Fisher. O método padrão (ISO 2098-1972) foi usado para calcular o teor de cinzas. O não glicerol orgânico (MONG) de glicerol foi medido subtraindo a soma dos conteúdos de glicerol, cinzas e água com base no método padrão (ISO 2464-1973). As determinações de pH para o glicerol bruto e purificado foram realizadas utilizando um medidor de pH (Cyberscan pH 300, 19 instrumentos Eutectic).

Concepção de experiências utilizando o método Taguchi

Neste estudo, o método Taguchi foi utilizado para projetar e otimizar o processo de purificação do glicerol bruto em duas etapas. O pacote de software Minitab 16 foi usado para auxiliar o desenho de experimentos e a análise estatística na determinação das condições ótimas de operação. Neste estudo, o conteúdo de glicerol (wt.%) foi usado como parâmetro para avaliar a eficácia do processo de acidificação sob diferentes condições de operação. Os dados obtidos para cada experimento em OA foram analisados pela razão sinal/ruído (razão S/R) para investigar o impacto de fatores influentes e determinar a configuração ótima dos parâmetros estabelecidos dentro do desenho experimental. A razão S/R pode ser otimizada usando vários critérios, incluindo quanto maior – melhor, menor – melhor, ou a nomeação – melhor.

Neste estudo, a abordagem maior – melhor foi empregada para avaliar a resposta experimental para a purificação do glicerol. A razão S/N foi calculada usando a Equação (1) (Park, 1996; Sharma et al., 2005):

onde “n” representa o número total de replicações de cada teste e Yi representa a pureza de glicerol no experimento de replicação “i” realizado sob as mesmas condições experimentais de cada teste. A razão S/N foi calculada para cada experimento. Os parâmetros significativos foram identificados com base na razão S/N da pureza da glicerina.

Análise da Média

Neste estudo, foi utilizada a Análise da Média (ANOM) para determinar a condição ótima de operação do processo de acidificação (Chary e Dastidar, 2012). A média da razão S/N mostra o efeito de cada parâmetro, independentemente. A média da razão S/N foi calculada calculando a média do valor da razão S/N de todos os experimentos.

A média da razão S/N de um parâmetro individual “F” no nível “I” foi calculada usando a Equação (2):

Onde nFi é o número de aparências do parâmetro “F” no nível “i” e j representa a razão S/N do parâmetro “F” no nível “i” no seu valor j (onde j = 1,2,3…, n).

Análise de variância

Análise de variância (ANOVA) foi realizada para avaliar estatisticamente o efeito de diferentes parâmetros sobre o desempenho do processo. A ANOVA foi realizada calculando-se a soma dos quadrados (SS), variância (V), graus de liberdade (DOF), razão de variância (fator F) e porcentagem de contribuição (ρF). Na ANOVA, a significância de todos os parâmetros e a interação entre os parâmetros foram investigadas utilizando as equações listadas abaixo. Segundo o método de Taguchi, a contribuição percentual de todos os parâmetros dos estudos foi utilizada para avaliar a influência de cada parâmetro no processo de acidificação e para investigar quais parâmetros afetaram significativamente a resposta do processo através da análise da ANOVA (Roy, 2001). A contribuição percentual de cada parâmetro, ρF, foi calculada usando a equação abaixo:

Na Equação (3), Ve é a variância devido a erro, DOFF é o grau de liberdade do parâmetro estudado, e pode ser calculado subtraindo-se um do número de nível do parâmetro (L).

As somas dos quadrados devidos ao fator, SSF foi calculado usando Equação (4):

Wh que, ηt = o total da razão S/N de cada parâmetro em ith nível, ηi é a razão S/N dos resultados experimentais e m é o número de repetição de cada nível do parâmetro.

O SST na Equação (3) foi calculado usando a Equação (5). SST é o total dos quadrados de soma, N é o número de todas as observações,

Soma dos quadrados por erro, SSe, foi calculado pela Equação (6):

A variação do parâmetro, Vp, foi calculada pela equação (7):

A razão Fisher (F) que determina o significado de um parâmetro foi calculada pela equação (8):

Confirmatory Experiments

Teste de confirmação foi realizado para verificar as condições óptimas propostas pela análise ANOM e ANOVA. A pureza de glicerol prevista e a razão S/N foram calculadas usando Equação (9):

where Ym = A média total da razão S/N, Yi¯ = razão S/N no nível ótimo, e k = número de parâmetros.

Resultados e Discussão

Caracterização do Glicerol Cru

O glicerol cru era um líquido castanho escuro com um pH de 9,6. Tem um pH superior ao do glicerol comercial. A glicerina bruta contém uma pequena quantidade de glicerol (46,8 wt.%), mas alto teor de cinzas, água e MONG, como pode ser visto na Tabela 6. É mostrado que a principal impureza no glicerol bruto é o teor de MONG (50,4 wt.%). O MONG é composto de impurezas como sabão, álcool e ésteres metílicos na glicerina das etapas de processamento do biodiesel (Kongjao et al., 2010). Os ácidos gordos livres formados serão libertados como um sabão solúvel. Além disso, os ésteres metílicos serão suspensos na fase de glicerol durante o processo de separação de fases (Kongjao et al., 2010). Estes compostos orgânicos também podem reagir com o catalisador alcalino em excesso, como NaOH ou KOH, que permanece na solução de glicerol para reformar o sabão. O teor de cinza (4,7 wt.%) é composto por matérias inorgânicas provenientes da utilização de catalisadores alcalinos como NaOH e KOH durante o processo de transesterificação. O teor de água de 9,3 wt.% na amostra de glicerol bruto é talvez devido à natureza higroscópica do glicerol que absorve a umidade do ambiente durante o processo de transesterificação.

Acidificação

Taguchi método foi usado para estudar o efeito dos parâmetros no desempenho do processo de acidificação e identificar a condição ideal de operação. Três parâmetros controláveis (pH, temperatura e tempo de reação) com cada parâmetro em três níveis diferentes foram usados para projetar o experimento. Com base nos parâmetros selecionados, níveis e graus de liberdade, foi escolhido um padrão L9 OA. Com base no método Taguchi, os resultados dos experimentos foram calculados no termo da relação S/R e depois interpretados. As razões S/R medem os desvios das características de qualidade em relação ao valor desejado e calculam as condições óptimas (Karabas, 2013). O objetivo deste estudo é maximizar a pureza do glicerol. Assim, características de qualidade superior são melhor desejadas. A equação (1) foi utilizada para determinar a razão S/N. As razões S/N de cada execução experimental foram obtidas pela substituição dos valores de pureza de glicerol e várias réplicas de cada execução experimental “n” na Equação (1).

Optimal Conditions by ANOM Approach

ANOM é usado para identificar o efeito sobre os parâmetros individuais e identificar a condição ótima para o processo de acidificação (Chary e Dastidar, 2012). Esta análise foi realizada através da média de todas as relações S/N daquele parâmetro particular utilizado nos experimentos. A equação (2) foi aplicada para calcular a média da razão S/R e os valores obtidos para cada experimento são apresentados na Tabela 7. As condições ótimas de operação foram determinadas com base na relação S/R máxima a um determinado nível. A média mais alta da razão S/R indica que o parâmetro tem um efeito mais forte no processo de acidificação. Como pode ser visto na Figura 1, as condições ótimas de operação para realizar a acidificação para obter a pureza máxima de glicerol foram identificadas como segue: pH no nível 2 (2), temperatura de reação no nível 3 (70°C) e tempo de reação no nível 2 (40 min). Os resultados obtidos com ANOM foram ainda verificados por ANOVA.

Efeito dos parâmetros na acidificação

A média das razões S/N reflete o nível dos parâmetros no processo de acidificação. Como mostrado na Figura 1, pH é o parâmetro dominante que afeta o processo de acidificação e qualidade do produto, seguido pela temperatura e tempo de reação. Isto indica que o parâmetro de pH é afetado criticamente pelo processo de acidificação e pela qualidade de um produto obtido. O significado dos parâmetros também foi obtido quantitativamente a partir da ANOM. Foi calculado através do cálculo do desvio do valor mais alto em relação ao valor mais baixo. A classificação mais alta foi atribuída ao parâmetro que apresentou o maior valor de desvio. Um grande desvio indica uma contribuição significativa e o efeito desse parâmetro em particular no desempenho do processo de acidificação. Como mostrado na Tabela 7, o pH foi o parâmetro mais significativo com um desvio de 2,32 e o tempo de reação foi o parâmetro menos significativo com um desvio de 0,41,

Percentagem de contribuição dos parâmetros pela ANOVA

Segundo o método de Taguchi, a porcentagem contribuída por cada parâmetro foi avaliada para quantificar com precisão o efeito do parâmetro sobre a acidificação em termos da pureza da glicerina (Roy, 2001). Os resultados da análise ANOVA e as contribuições percentuais de cada parâmetro são mostrados na Tabela 8. Observou-se que o pH teve um efeito dominante no processo de acidificação, com a contribuição percentual de 76,37%. A contribuição dos parâmetros foi encontrada na seguinte ordem: pH (76,37%) > temperatura (19,44%) > tempo de reação (2,72%). Este resultado foi de acordo com os resultados obtidos na análise ANOM.

Confirmation Experiments

Confirmation experiment is an important step in the Taguchi design method. Esta etapa deve ser realizada no final do estudo de otimização para verificar se as condições de operação otimizadas, que são identificadas usando ANOM, produzem o resultado experimental desejado. A combinação das condições ótimas de operação identificadas não foi incluída nas nove séries experimentais da matriz ortogonal. Como tal, foi realizado um experimento de confirmação para o processo de acidificação usando o valor otimizado de cada parâmetro e a relação S/N foi calculada. A pureza do glicerol foi estimada usando a Equação (9) e a comparação entre a pureza real e prevista do glicerol é apresentada na Tabela 9. Como pode ser visto na Tabela 9, a razão S/N obtida do experimento de confirmação está em boa concordância com as previstas. Esses resultados mostraram que a otimização do processo de acidificação para produzir glicerol de maior pureza foi bem sucedida.

Troca de íons

Três parâmetros controláveis (quantidade de resina, quantidade de solvente e vazão) com cada parâmetro em três níveis diferentes foram otimizados usando o projeto experimental de matrizes ortogonais Taguchi. Com base no número de parâmetros identificados, vários níveis e graus de liberdade, um padrão L9 OA foi selecionado no estudo atual. Um total de vinte e sete execuções experimentais foram realizadas com base no L9 OA com três réplicas. Para cada série experimental, a resposta do processo em termos de pureza de glicerol (wt.%) foi determinada e posteriormente analisada pela abordagem estatística. Os dados coletados sobre a pureza da glicerina foram apresentados na Tabela 5. Com base nos resultados obtidos, a pureza da glicerina (wt.%) dos experimentos variou de 87,04 a 97,87 wt.%. Isso indica que o processo de troca iônica depende de todos os parâmetros controláveis (quantidade de resina, quantidade de solvente e vazão), e esse achado foi comprovado ainda mais pela análise estatística. Os resultados dos experimentos foram convertidos na razão S/N. Este estudo visa maximizar a pureza do glicerol obtido a partir do processo de troca iônica. Assim, características de maior qualidade são utilizadas para calcular a razão S/N.

Optimal Conditions by ANOM Approach

A média da razão S/N obtida para o experimento é apresentada na Tabela 10. As condições ótimas de operação foram selecionadas com base no valor máximo da razão S/N em um determinado nível de um parâmetro. Um efeito mais forte no processo de troca iônica é indicado por uma média mais alta da razão S/N. Portanto, as condições ótimas de operação para os parâmetros foram obtidas no nível com a maior média da razão S/N. Como mostrado na Figura 2, as condições ótimas de operação para o processo de troca iônica para atingir a pureza máxima de glicerol foram identificadas como segue: a quantidade de resina no nível 3 (40 g), a taxa de fluxo no nível 1 (15 mL/min) e a quantidade de solvente no nível 3 (60%). Os resultados obtidos com ANOM foram ainda verificados por ANOVA.

Efeito dos parâmetros na troca iônica

A variação da média da razão S/N reflete o nível de influência dos parâmetros no processo de troca iônica. Como mostrado na Figura 2, a taxa de fluxo foi o parâmetro dominante afetando o processo de troca iônica e a qualidade do produto, seguido pela quantidade de resina e quantidade de solvente. O significado desses parâmetros também foi obtido quantitativamente a partir da ANOM. Ele foi determinado calculando o desvio do valor mais alto em relação ao valor mais baixo. A classificação mais alta foi atribuída ao parâmetro com o maior valor de desvio. Um desvio substancial indica uma contribuição significativa e o efeito desse parâmetro em particular no desempenho do processo de troca iônica. Como mostrado na Tabela 10, a taxa de fluxo foi o principal parâmetro contribuinte e a quantidade de solvente foi o parâmetro de menor contribuição.

Percentagem de contribuição dos parâmetros pela ANOVA

Os resultados da ANOVA sobre a pureza do glicerol e a porcentagem de contribuição de cada parâmetro são apresentados na Tabela 11. Ficou claro pelo resultado que a taxa de fluxo exibiu um efeito dominante no processo de troca iônica com a porcentagem de contribuição de 51,02%. A contribuição dos parâmetros em ordem ascendente como segue: taxa de fluxo (51,02%) > quantidade de resina (28,42%) > quantidade de solvente (12,33%). Os resultados experimentais foram de boa concordância com os resultados obtidos na análise ANOM.

Confirmation Experiment

O modelo previu 96,91% de pureza de glicerol, e relação S/N de 39,72 sob as condições ótimas de 60% de solvente, taxa de fluxo de 15 ml/min, e 40 g de resina. Os valores obtidos experimentalmente foram comparados com o valor previsto pelo modelo para confirmar a validade do procedimento de otimização sob as condições operacionais estabelecidas. O resultado mostra que uma pureza máxima de glicerol (98,2%) e a relação S/R de 39,78 foram obtidas utilizando as condições de operação otimizadas. Os resultados dos experimentos de confirmação revelaram que o valor experimental real e a relação S/R obtida estavam em boa concordância com os previstos. Portanto, pode-se concluir que a otimização do processo de troca iônica para melhorar a pureza do glicerol foi bem sucedida.

Comparação da Característica do Glicerol Purificado com Outros Trabalhos

O resultado obtido neste trabalho foi comparado com estudos anteriores e apresentado na Tabela 12. A tabela de comparação mostra que o método de purificação em duas etapas, composto por técnicas de acidificação e troca iônica aplicadas neste trabalho, produziu glicerol com maior pureza em comparação com outros trabalhos. A percentagem de glicerol bruto purificado obtido neste estudo foi de 98%. Saifuddin et al. (2013) conseguiram um menor rendimento de glicerol com a pureza de 93,1-94,2%, utilizando tanto o tratamento de acidificação como de adsorção, em comparação com este trabalho. Além disso, nossas técnicas de purificação em duas etapas foram mais eficazes e superiores em comparação ao tratamento químico e físico utilizado por Manosak et al. (2011) e Kongjao et al. (2010) em termos de pureza de glicerol.

Conclusão

Este trabalho tem como objectivo obter glicerol de alta pureza através do processo de purificação em duas etapas com a ajuda da ferramenta de optimização Taguchi. O processo de acidificação e seguido pela troca iônica produziram glicerol com a pureza de 98,20 wt.%. Nas condições otimizadas de pH (2), temperatura (70°C) e tempo de reação (40 min), o processo de acidificação obteve glicerol com uma pureza de 76,18 wt.%. No processo de troca iônica, foi utilizado o glicerol pré-tratado, que foi obtido a partir do processo de acidificação com condições de operação otimizadas. O processo de troca iônica obteve glicerol com a pureza de 98,20 wt.% nas condições otimizadas de 60% de solvente, a taxa de fluxo de 15 mL/min, e 40 g de resina. Os valores previstos pelo método de Taguchi foram comparados com os dos resultados experimentais reais, e o resultado real foi encontrado em boa concordância com o resultado previsto. Está demonstrando que Taguchi foi aplicado com sucesso para otimizar as duas etapas de purificação do glicerol bruto derivado do biodiesel. Este estudo mostra uma melhora na pureza da glicerina de 35,60 para 98,20 wt.% após a otimização dos processos de acidificação e troca iônica, sendo o conteúdo de glicerina na quantidade aceita com base em BS 2621:1979.

Author Contributions

HT: desenho do trabalho, trabalho experimental, análise e interpretação dos dados, e redação do manuscrito. AA: conceito do estudo, desenho do trabalho e revisão do manuscrito. AB: análise e interpretação dos dados e redação do manuscrito.

Conflito de interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Confirmações

Os autores agradecem à Universiti Malaya Research Grant (UMRG) – Frontier Science (AFR) RG384-17AFR Research Fund from the University of Malaya por apoiar financeiramente esta pesquisa.