Fluorescência

Fluorescência é uma luminescência que se encontra principalmente como um fenómeno óptico em corpos frios, em que a absorção molecular de um fotão a um determinado comprimento de onda desencadeia a emissão de outro fotão com um comprimento de onda mais longo. A substância que fluoresce é chamada fluoróforo. A diferença de energia entre os fótons absorvidos e emitidos acaba como vibração molecular ou calor. Normalmente o fotão absorvido está na faixa ultravioleta e a luz emitida está na faixa visível, mas isto depende do fluoróforo utilizado e de outros fatores.

Fluorescência tem o nome do fluorito mineral, composto de fluoreto de cálcio, que freqüentemente exibe este fenômeno. Uma variedade de outros minerais e materiais orgânicos também fluorescem, e são utilizados para uma série de diferentes aplicações. Por exemplo, a fluorescência é útil para a iluminação e marcação de moléculas em química analítica e bioquímica. Os fluoróforos têm sido usados para rotular células, anticorpos e outras estruturas biológicas, e para determinar as suas estruturas e modos de acção.

Exemplos de materiais fluorescentes

Gem pedras, minerais, fibras e muitos outros materiais que podem ser encontrados em forenses ou com relação a vários colecionáveis podem ter uma fluorescência distinta ou podem fluorescer de forma diferente sob raios ultravioleta de onda curta, ultravioleta de onda longa, ou raios X.

Muitos tipos de calcita e âmbar irão fluorescer sob raios UV de onda curta. Rubis, esmeraldas e o Diamante Esperança apresentam fluorescência vermelha sob luz UV de onda curta; diamantes também emitem luz sob radiação de raios X.

O óleo de rúde (petróleo) fluoresce em uma gama de cores, desde o marrom baço para óleos pesados e alcatrões até o branco amarelado e azulado brilhante para óleos muito leves e condensados. Este fenómeno é utilizado na perfuração de exploração petrolífera para identificar quantidades muito pequenas de óleo em brocas e amostras de núcleo.

Líquidos orgânicos, como misturas de antraceno em benzeno ou tolueno, ou stilbeno nos mesmos solventes, fluorescem com irradiação ultravioleta ou raios gama. Os tempos de decaimento desta fluorescência são da ordem de nanossegundos uma vez que a duração da luz depende da duração dos estados excitados do material fluorescente, neste caso antraceno ou estilbeno.

Aplicações

Existem muitos compostos naturais e sintéticos que exibem fluorescência, e que têm uma série de aplicações. Alguns animais de águas profundas, como o Greeneye, usam fluorescência.

Lighting

O tubo fluorescente comum depende da fluorescência. Dentro do tubo de vidro há um vácuo parcial e uma pequena quantidade de mercúrio. Uma descarga eléctrica no tubo faz com que os átomos de mercúrio emitam luz. A luz emitida está na faixa de ultravioleta (UV), é invisível e é prejudicial para a maioria dos organismos vivos. O tubo é revestido com um revestimento de um material fluorescente, chamado fósforo, que absorve o ultravioleta e reemita a luz visível. A iluminação fluorescente é muito eficiente em termos energéticos em comparação com a tecnologia incandescente, mas os espectros produzidos podem causar o aparecimento de certas cores não naturais.

Em meados dos anos 90, os diodos emissores de luz (LEDs) brancos tornaram-se disponíveis, que funcionam através de um processo semelhante. Tipicamente, o semicondutor emissor de luz real produz luz na parte azul do espectro, que atinge um composto fosforoso depositado no chip; o fósforo fluoresce da parte verde para a parte vermelha do espectro. A combinação da luz azul que atravessa o fósforo com a luz emitida pelo fósforo produz uma emissão líquida de luz branca.

Diz-se que a luz moderna de vapor de mercúrio foi desenvolvida a partir da lâmpada fluorescente.

Paus brilhantes oxidam o éster de oxalato de fenilo para produzir luz.

A iluminação fluorescente compacta (LFC) é a mesma que qualquer lâmpada fluorescente típica com vantagens. É auto-balastada e utilizada para substituir as incandescentes na maioria das aplicações. Elas produzem um quarto do calor por lúmen como lâmpadas incandescentes e duram cerca de cinco vezes mais. Estas lâmpadas contêm mercúrio e devem ser manuseadas e eliminadas com cuidado.

Química Analítica

Fluorescência em vários comprimentos de onda pode ser detectada por um detector de matriz, para detectar compostos do fluxo de HPLC. Também é possível visualizar placas de cromatografia em camada fina (TLC) se os compostos ou um reagente colorante forem fluorescentes.

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Posições digitais podem ser visualizadas com compostos fluorescentes como a ninidrina.

Bioquímica e medicina

As moléculas biológicas podem ser marcadas com um grupo químico fluorescente (fluoróforo) por uma simples reação química, e a fluorescência da marca permite a detecção sensível e quantitativa da molécula. Exemplos incluem:

• Microscopia de fluorescência de tecidos, células ou estruturas subcelulares é realizada rotulando um anticorpo com um fluoróforo e permitindo que o anticorpo encontre o seu antígeno alvo dentro da amostra. A marcação de múltiplos anticorpos com diferentes fluoróforos permite a visualização de múltiplos alvos dentro de uma única imagem.
• Sequenciamento automatizado do DNA pelo método de terminação em cadeia; cada uma das quatro bases de terminação em cadeia diferentes tem a sua própria etiqueta fluorescente específica. Como as moléculas de DNA etiquetadas são separadas, a etiqueta fluorescente é excitada por uma fonte UV, e a identidade da base terminante da molécula é identificada pelo comprimento de onda da luz emitida.
• Detecção de ADN: o brometo de etídio composto, quando livre para alterar a sua conformação em solução, tem muito pouca fluorescência. A fluorescência do brometo de etídeo é muito melhorada quando se liga ao DNA, por isso este composto é muito útil na visualização da localização dos fragmentos de DNA na eletroforese em gel de agarose. O brometo de etídio pode ser tóxico; uma alternativa mais segura é o corante SYBR Green.
• O microarranjo de DNA
• Immunologia: Um anticorpo tem um grupo químico fluorescente ligado, e os locais (por exemplo, numa amostra microscópica) onde o anticorpo foi ligado podem ser vistos, e até quantificados, pela fluorescência.
• FACS (classificação celular activada por fluorescência)
• Fluorescência tem sido usada para estudar a estrutura e conformações do ADN e proteínas com técnicas como a transferência de energia de ressonância de fluorescência, que mede a distância ao nível do angstrom. Isto é especialmente importante em complexos de biomoléculas múltiplas.
• Aequorin, da medusa Aequorea victoria, produz um brilho azul na presença de íons Ca2+ (por uma reação química). Tem sido utilizado para imaginar o fluxo de cálcio nas células em tempo real. O sucesso com a aequorin estimulou uma investigação mais aprofundada da A. victoria e levou à descoberta da Proteína Fluorescente Verde (GFP), que se tornou uma ferramenta de investigação extremamente importante. A GFP e proteínas relacionadas são utilizadas como repórteres para qualquer número de eventos biológicos, incluindo coisas como a localização sub-celular. Os níveis de expressão gênica são às vezes medidos ligando um gene para a produção de GFP a outro gene.

Além disso, muitas moléculas biológicas têm uma fluorescência intrínseca que às vezes pode ser usada sem a necessidade de anexar uma etiqueta química. Às vezes esta fluorescência intrínseca muda quando a molécula está em um ambiente específico, assim a distribuição ou ligação da molécula pode ser medida. A bilirrubina, por exemplo, é altamente fluorescente quando ligada a um local específico na albumina do soro. A protoporfirina de zinco, formada no desenvolvimento de glóbulos vermelhos em vez de hemoglobina quando o ferro não está disponível ou o chumbo está presente, tem uma fluorescência brilhante e pode ser usada para detectar estes problemas.

A partir de 2006, o número de aplicações da fluorescência está crescendo nas ciências biomédicas biológicas e afins. Os métodos de análise nestes campos também estão crescendo, embora com nomenclatura cada vez mais infeliz sob a forma de siglas, como por exemplo: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. A maior parte destas técnicas utiliza microscópios de fluorescência. Estes microscópios utilizam fontes de luz de alta intensidade, geralmente lâmpadas de mercúrio ou xenônio, LEDs ou lasers, para excitar a fluorescência nas amostras sob observação. Os filtros ópticos separam então a luz de excitação da fluorescência emitida, a ser detectada a olho nu, ou com uma câmara (CCD) ou outros detectores de luz (tubos fotomultiplicadores, espectrógrafos, etc.). Muitas pesquisas estão em curso para melhorar as capacidades desses microscópios, as sondas fluorescentes utilizadas e as aplicações a que são aplicados. Particularmente importante são os microscópios confocais, que utilizam um orifício para obter uma secção óptica – fornecendo uma visão quantitativa e 3D da amostra.

Segurança

Lâmpadas fluorescentes criam muito menos calor residual do que as lâmpadas incandescentes e halógenas. As lâmpadas de halogéneo estão implicadas num grande número de incêndios, e as lâmpadas incandescentes também apresentam um maior risco de incêndio do que as lâmpadas fluorescentes, devido ao calor desperdiçado. As lâmpadas podem tombar acidentalmente, ou às vezes por eventos como terremotos. O uso de lâmpadas fluorescentes pode, portanto, ser um meio de prevenção de incêndios acidentais. No entanto, as lâmpadas fluorescentes podem conter mercúrio, e a quebra de tal lâmpada pode resultar num dispendioso derrame de mercúrio.

Considerações teóricas

Fotoquímica

Fluorescência ocorre quando uma molécula ou ponto quântico relaxa até ao seu estado de solo após ter sido excitada electronicamente.

Excitação: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu {1}to S_{1}}

Fluorescência (emissão): S 1 → S 0 + h ν {\\i1}sim como S_{0}+hnu } , aqui h ν {\i1}displaystyle h\i} é um termo genérico para energia fotônica onde: h = constante do Planck e ν {\displaystyle \dnu } = frequência da luz. (As frequências específicas de excitação e emissão de luz dependem do sistema particular.)

O estado S0 é chamado de estado do fluoróforo (molécula fluorescente) e S1 é o seu primeiro estado excitado (eletronicamente).

Uma molécula no seu estado excitado, S1, pode relaxar por vários caminhos concorrentes. Ela pode sofrer um “relaxamento não-radiativo” no qual a energia de excitação é dissipada como calor (vibrações) para o solvente. As moléculas orgânicas excitadas também podem relaxar através da conversão para um estado triplet, que pode subsequentemente relaxar através da fosforescência ou por um passo secundário de relaxamento não-radiativo.

Relaxação de um estado S1 também pode ocorrer através da interacção com uma segunda molécula através da têmpera por fluorescência. O oxigénio molecular (O2) é um supressor de fluorescência extremamente eficiente devido ao seu estado trigémeo invulgar.

Moléculas que são excitadas através da absorção de luz ou através de um processo diferente (por exemplo, como o produto de uma reacção) podem transferir energia para uma segunda molécula ‘sensibilizada’, que é convertida para o seu estado excitado e pode então fluorescer. Este processo é usado em tubos fluorescentes.

Rendimento quântico de fluorescência

O rendimento quântico de fluorescência dá a eficiência do processo de fluorescência. É definido como a razão entre o número de fotões emitidos e o número de fotões absorvidos.

Φ = # p h o t o n s e m i t o d # p h o t o n s a b s o r b e d {\i1}phi ={\i1}frac {\i1}fotões emitidos}{\i1}{\i1}fotões absorvidos}}}}

O rendimento máximo de fluorescência quântica é de 1,0 (100 por cento); cada fotão absorvido resulta num fotão emitido. Compostos com rendimentos quânticos de 0,10 ainda são considerados bastante fluorescentes. Outra forma de definir o rendimento quântico de fluorescência, é através das taxas de decaimento do estado excitado:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {\k}_{f}}{sum _{\i}{k}_{i}}}}

where k f {\i}displaystyle {k}_{f}} é a taxa de emissão espontânea de radiação e

∑ i k i {\i}displaystyle {\i} _{k}_{i}}

é a soma de todas as taxas de decadência do estado excitado. Outras taxas de decaimento do estado excitado são causadas por outros mecanismos além da emissão de fótons e, portanto, são freqüentemente chamadas de “taxas não-radiativas”, que podem incluir: resfriamento dinâmico por colisão, interação dipolo/dipolo próximo ao campo (ou transferência de energia por ressonância), conversão interna e cruzamento entre sistemas. Assim, se a taxa de qualquer caminho mudar, isso afetará tanto a vida útil do estado excitado quanto a produção quântica de fluorescência.

A produção quântica de fluorescência é medida por comparação com um padrão com a quantologia conhecida; o sal quinino, sulfato de quinino, em uma solução de ácido sulfúrico é um padrão de fluorescência comum.

Vida da fluorescência

Vida da fluorescência refere-se ao tempo médio que a molécula permanece no seu estado excitado antes de emitir um fóton. A fluorescência normalmente segue a cinética de primeira ordem:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle {\displaystyle {\displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyle \displaystyleé a concentração de moléculas de estado excitado no momento t {\i1}displaystyle t, 0 {\i1}displaystyle {\i}left_{\i}é a concentração inicial e Γ é o estilo de jogo da Gammaé a taxa de decaimento ou o inverso da vida útil da fluorescência. Esta é uma instância de decadência exponencial. Vários processos radiativos e não radiativos podem de-popular o estado excitado. Neste caso, a taxa de decaimento total é a soma de todas as taxas: Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\i1}gamma _{\i}===Gamma _{\i}+=Gamma _{\i}}

where Γ t o t {\i1}displaystyle {\i}Gamma _{\i} é a taxa de decaimento total, Γ r a d {\i1}Gamma _{\i} a taxa de decaimento radiativo e Γ n r a d {\i1}displaystyle {\i}Gamma _{\i} a taxa de decadência não-radiativa. É semelhante a uma reação química de primeira ordem em que a constante de taxa de primeira ordem é a soma de todas as taxas (um modelo cinético paralelo). Se a taxa de emissão espontânea, ou qualquer outra taxa for rápida, o tempo de vida é curto. Para os compostos fluorescentes comumente usados, os tempos típicos de decaimento do estado excitado para compostos fluorescentes que emitem fótons com energias do UV para infravermelho próximo estão dentro da faixa de 0,5 a 20 nanossegundos. A vida útil da fluorescência é um parâmetro importante para aplicações práticas de fluorescência como a transferência de energia por ressonância de fluorescência.

Regras

Há várias regras que lidam com a fluorescência. A regra Kasha-Vavilov dita que o rendimento quântico da luminescência é independente do comprimento de onda da radiação excitante.

Esta regra nem sempre é válida e é violada severamente em muitas moléculas simples. Uma afirmação um pouco mais confiável, embora ainda com exceções, é que o espectro de fluorescência mostra muito pouca dependência do comprimento de onda da radiação excitante.

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Veja também

• Fluoresceína
• Lâmpada fluorescente
• Lâmpada luminosa
• Fosforescência
• Raios-X

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Fotoquímica Molecular Moderna. Mill Valley, CA: Livros de Ciências da Universidade. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Fluorescência Molecular: Princípios e Aplicações. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Todos os links recuperados em 14 de abril de 2017.

• Fluoróforos.org A base de dados de corantes fluorescentes
• Fluorescência no Mundo da Ciência
• Conceitos básicos em Fluorescência