Fase 1 Ensaio clínico de Trametes versicolor em mulheres com cancro da mama

Abstract

Introdução. Os preparados de Trametes versicolor (Tv), administrados oralmente, têm sido hipotéticos para melhorar a resposta imunológica em mulheres com câncer de mama após quimioterapia e radioterapia padrão. Métodos. Um estudo fase I, de dois centros, de escalonamento de dose foi feito para determinar a dose máxima tolerada de um preparado de Tv quando tomado diariamente em doses divididas durante 6 semanas após a conclusão recente da radioterapia. Onze participantes foram recrutados e nove mulheres completaram o estudo. Cada coorte foi composta por três participantes a quem foi administrada uma das três doses de Tv (3, 6 ou 9 gramas). Os dados imunológicos foram coletados antes e depois do tratamento, em 3 pontos de tempo de tratamento e após 3 semanas de washout. Resultados. Nove eventos adversos foram relatados (7 leves, 1 moderado e 1 grave), sugerindo que a Tv foi bem tolerada. Resultados imunológicos indicaram tendências em (1) aumento da contagem de linfócitos em 6 e 9 gramas/dia; (2) aumento da atividade funcional das células naturais assassinas em 6 gramas/dia; (3) aumentos relacionados à dosagem em células CD8+ T e células CD19+ B, mas não em células CD4+ T ou células CD16+56+ NK. Conclusão. Estes achados mostram que até 9 gramas/dia de um preparado de TV é seguro e tolerável em mulheres com câncer de mama no ambiente de tratamento pós-primário. Esta preparação de Tv pode melhorar o estado imunológico em pacientes com câncer de mama imunocomprometidas após o tratamento oncológico primário padrão.

1. Introdução

Trametes versicolor (Tv), também conhecido como Coriolus versicolor e comumente chamado de Cauda de Peru, é uma espécie de cogumelo a partir do qual foram feitas preparações que têm uma longa história de uso na medicina tradicional asiática . Duas frações de proteoglicanos, polissacarídeo K (PSK) e Polissacarídeo Peptídeo (PSP), são extratos semelhantes de água quente da Tv com atividade anticancerígena relatada. No Japão, PSK é prescrito rotineiramente a pacientes com câncer, tanto durante e após a radiação e quimioterapia . É também uma prática comum entre muitos médicos naturopatas (DT) e oncologistas integradores (MD) nos EUA prescrever TV inteira, liofilizada, para pacientes com câncer de mama . A atividade imunológica da tv é hipotética como sendo o principal mecanismo subjacente responsável pelos seus efeitos antitumorais, bem como pelo seu impacto nas taxas de sobrevida. O mecanismo de ação da Trametes versicolor envolve o aumento das respostas imunológicas inatas e adaptativas, pelo menos em parte através da atividade agonista do receptor Toll-like 2. Estudos pré-clínicos com animais e dados clínicos preliminares suportam a hipótese de que os derivados da Tv podem ser benéficos no tratamento tanto de cancros positivos como negativos dos receptores de estrogênio, mitigando os efeitos imunológicos depressivos do tratamento e aumentando a sobrevida livre de doenças através do aumento da vigilância imunológica e da superação da tolerância ao antígeno tumoral .

A compreensão de como os fatores imunológicos são influenciados pelos tratamentos do câncer de mama sugere áreas promissoras de foco no desenvolvimento de terapias adjuntivas para fortalecer as respostas imunológicas antitumorais. Dados recentes demonstram que certas classes de medicamentos quimioterápicos causam a morte imunogênica das células tumorais, o que leva ao aumento da apresentação cruzada de antígenos e estimulação da resposta imunológica antitumoral. As evidências sugerem que as células NK desempenham um papel importante na prevenção do câncer de mama, tanto precoce como metastático. Alguns pacientes com câncer de mama têm sido relatados com falta de atividade das células NK contra as células alvo K562 . Dados atuais sugerem que pacientes com câncer de mama que completaram cirurgia, quimioterapia e radioterapia apresentam déficit imunológico . Andersen et al. relataram que os níveis de estresse em pacientes com câncer de mama previram significativamente uma menor lise das células NK, bem como uma resposta proliferativa menor aos linfócitos do sangue periférico . Nosso estudo de observação anterior confirmou que linfopenia e baixa atividade das células NK estavam presentes durante as 6 semanas após a conclusão da radioterapia .

Para entender melhor o benefício potencial do Trametes versicolor em mulheres com câncer de mama, foi necessário um estudo de aumento de dose para avaliar a segurança e tolerabilidade. Para este fim, uma equipe multidisciplinar da Universidade de Minnesota e da Universidade de Bastyr completou um estudo de escalonamento de dose fase 1 para determinar a segurança e a dose máxima tolerada de Tv em mulheres diagnosticadas com câncer de mama que foram submetidas a tratamento padrão para câncer de mama e estavam dispostas a participar de um estudo de nove semanas após a radioterapia.

2. Métodos

2.1. Escalação da Dose de Estudo

Foi utilizado um desenho padrão de fase 1 com 3 sujeitos por nível de dose até que a DTM (dose máxima tolerada) seja atingida. O programa de escalonamento de dose para cada coorte de Tv foi de 3 gm (a dose mais utilizada); 6 gm; 9 gm; 12 gm; 18 gm; 24 gm. Este estudo foi recrutado apenas através da coorte de nove gramas (𝑁=9).

2.2. Participantes do estudo

Mulheres entre 21 e 75 anos de idade, diagnosticadas com câncer de mama de estágio I, II ou III e que tinham sido submetidas a cirurgia e quimioterapia e estavam prontas para iniciar a radioterapia, foram inscritas no estudo após darem consentimento por escrito. A elegibilidade também incluiu a vontade de comer uma dieta consistente ao longo do estudo, e evitar fontes dietéticas de cogumelos e outros produtos herbais com efeitos imunomoduladores relatados durante a radioterapia e até a conclusão do estudo. As funções hematológicas, renais e hepáticas de base dentro dos limites normais foram requeridas antes de se inscrever no estudo. O estudo foi conduzido no Centro de Câncer da Universidade de Minnesota em Minneapolis, Minnesota e Bastyr University em Ken more, Washington. O estudo foi aprovado pelos comitês do IRB da Universidade de Minnesota e da Universidade de Bastyr. Entre janeiro de 2008 e junho de 2010, onze mulheres com câncer de mama estágio I-III preencheram os critérios restritos para este estudo, consentiram em participar e foram inscritas sequencialmente a partir da coorte de dosagem mais baixa. Três participantes em cada uma das coortes de 3 gm, 6 gm, e 9 gm completaram o estudo. Dois dos participantes se retiraram do estudo após visitarem dois, devido a dificuldades com o transporte para a clínica. As características das nove mulheres que completaram o estudo incluíram uma faixa etária de 38 a 68 anos; seis ER negativas e três ER positivas; três fase I; duas fase II e quatro fase III cancros mamários. Uma das mulheres que completou o estudo não fez quimioterapia antes da radiação, e uma violação do protocolo de elegibilidade foi relatada ao IRB.

2,3. O objetivo principal do estudo foi avaliar a segurança e tolerabilidade de Trametes versicolor em mulheres com câncer de mama no ambiente pós-tradioterapia. Os nove participantes do estudo de escalonamento de dose foram monitorados para eventos adversos (EA) usando métodos clínicos e laboratoriais e critérios de toxicidade limite de dose (DLT) definidos como qualquer toxicidade relacionada ao tratamento de Grau 2 ou maior, como pontuado usando o NCI’s Common Terminology Criteria for Adverse Events V 3.0 (CTCAE). As mulheres foram rastreadas semanalmente para eventos adversos durante a administração do produto, seja em sua visita clínica ou por telefone, entre as visitas. O objetivo secundário era coletar dados preliminares que comparassem as linhas de base da terapia pré e pós-tratamento, medidas imunológicas no tratamento e pós-tratamento, incluindo o hemograma completo com atividade celular diferencial, natural killer (NK), ensaio de células reguladoras T, ensaio de subconjunto de células T/B/NK, índice fagocitário e níveis de citocinas. A análise estatística, incluindo testes t de amostras independentes e ANOVAs unidirecionais com comparação múltipla post hoc da Turquia, foi realizada usando GraphPad Prism, Versão 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). A fim de aumentar a potência e o tamanho da amostra, os dados de um estudo observacional (𝑁=14) realizado por nossos centros desde 2006 foram combinados com o estudo de escalonamento de dose atual (𝑁=9). Os critérios de elegibilidade foram idênticos para ambos os estudos (𝑁=23).

2.4. Cogumelo Produto Drogas

Trametes versicolor pó micelial liofilizado foi obtido de Paul Stamets at Fungi Perfecti, Inc., Olympia, WA e foi encapsulado por Beehive Botanicals (Hayward, WI). Cada cápsula continha 500 mg de produto. A aprovação do FDA IND (# 75.405) foi obtida em 2007.

2.5. Apreensões Imunológicas

2.5.1. Hemograma completo com diferencial

Os testes laboratoriais clínicos (hemograma, química, testes de gravidez sérica e urinálise) foram realizados no Departamento de Medicina Laboratorial da Universidade de Washington para participantes recrutados no local da Universidade de Bastyr e no Laboratório de Diagnóstico Fairview da Universidade de Minnesota para participantes recrutados no local da U de Minnesota.

2.5.2. Atividade Funcional das Células Assassinas Naturais

O subconjunto de células imunes medido incluiu atividade das células NK, ensaio de células reguladoras T, ensaio do subconjunto de células T/B/NK, índice fagocitário, e níveis de citocinas. Foram realizados ensaios imunológicos no laboratório da Universidade de Bastyr para indivíduos recrutados em ambos os locais. O sangue coletado no Centro de Pesquisa Clínica Geral da Universidade de Minnesota (GCRC) foi enviado de um dia para a Universidade de Bastyr. A qualidade do sangue transportado da Universidade de Minnesota para Bastyr foi avaliada pelos seguintes critérios. Para amostras com mais de 48 horas quando chegaram ao laboratório de Bastyr, os linfócitos foram isolados, e a viabilidade celular foi determinada pela coloração azul-tripano. Se a viabilidade foi superior a 80%, o ensaio foi realizado. Se a viabilidade fosse inferior a 80%, os espécimes eram rejeitados. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por gradiente Ficoll-Hypaque (densidade = 1,070 g/mL), lavadas duas vezes em PBS, e mantidas em RPMI 1640, 10% FBS com 2 mM L-Gln e penicilina-estreptomicina (1000 U/mL; 1 mg/mL). A atividade celular NK destas amostras de PBMC, medida pela capacidade de matar células-alvo tumorais K562, foi avaliada em triplicata na razão effector to target (E : T) de 50 : 1, 25 : 1, e 12,5 : 1 seguindo métodos publicados . As células-alvo foram rotuladas com 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiOC18) e co-cultivadas com células efetoras PBMC por quatro horas. Uma amostra de controle com células K562 foi incluída apenas para determinar a morte espontânea da célula alvo. Após a incubação, foi adicionado iodeto de propidio para detectar células mortas. A percentagem de células alvo mortas foi determinada subtraindo a percentagem de lises espontâneas da percentagem de lise específica (PSL) do respectivo E : T. Para representar a atividade padronizada das células NK, as unidades líticas foram calculadas por um programa de software previamente publicado e validado usando os seguintes parâmetros: alvo por poço = 10.000; LU por célula nº = 107; curva máxima = 48; percentual de lisos = 20 . Valores LU20, definidos como os valores E : T, na qual 20% da morte da célula alvo ocorre, foram extrapolados a partir das curvas dose-resposta da PSL versus log E : Razão T para cada amostra de sangue testada .

2.5.3. Imunofenotipagem PBMC Subsets

PBMC suspensões (5×105 células) foram colocadas em 3 tubos, lavadas em PBS, spun down, sobrenadantes como piratas e pastilhas de células ressuspensas em 100 μL PBS. Os PBMCs no tubo 1 foram corados por CD3-PC5, CD4-PE e CD8-FITC; tubo 2: CD3-PC5, CD16-FITC e CD56-PE; tubo 3: CD14-PC5. Os tubos foram vortexados brevemente, cobertos e incubados em gelo durante 15 minutos, após os quais as células foram lavadas em PBS frio duas vezes, ressuspendidas a 0.5 mL em PBS e por cento de subconjuntos PBMC determinados por análise citométrica de fluxo usando um Beckman Coulter FC500 e software CXP.

2.6. Protocolo de ensaios clínicos

A duração do estudo foi de nove semanas e teve início após a conclusão da radioterapia. Incluiu seis semanas de uso do produto seguido por um período de três semanas de lavagem sem uso do produto (Figura 1). Os pacientes foram rastreados e determinados elegíveis para o estudo após a conclusão da quimioterapia e antes do início da radioterapia. O estudo exigiu seis visitas aos centros de pesquisa clínica. A primeira visita ao estudo ocorreu antes do início da radioterapia, na qual os laboratórios de linha de base foram desenhados. Na primeira semana após a conclusão da radiação, os participantes tiveram sua segunda visita, na qual os laboratórios foram desenhados, e o estudo de nove semanas foi iniciado. Seis semanas de produto de TV foram fornecidas ao participante, que retornou ao centro de pesquisa para visitar três, quatro, e cinco, com duas semanas de intervalo para o sorteio do laboratório e avaliação da tolerabilidade do produto e eventos adversos. A visita final (sexta) foi às nove semanas, após três semanas sem produto, para um sorteio final e avaliação de qualquer evento adverso prolongado.

O protocolo de escalonamento de dose envolveu coortes de um mínimo de três participantes que ingeriram a TV oralmente em doses divididas diariamente durante seis semanas. A primeira coorte tomou 3 gramas/dia em duas doses divididas; a segunda coorte tomou 6 gramas/dia em duas doses divididas; a terceira coorte tomou 9 gramas/dia em três doses divididas. Três gramas por dia é a dose mais utilizada na prática médica naturopática e até 9 gramas é utilizada no Japão. O objetivo do estudo foi determinar a dose máxima tolerada (DTM) que demonstrou segurança e tolerabilidade (Tabela 1).

3. Resultados

3.1. Eventos adversos

Os resultados deste estudo de escalonamento da dose mostraram que até 9 gramas/dia de preparação da TV foi bem tolerado em mulheres com câncer de mama por seis semanas no ambiente de tratamento pós-tradiação. Houve nove eventos adversos; sete eventos adversos leves, um moderado e apenas um de grau 3 que foi um ataque de ansiedade em uma participante que provavelmente não estava relacionado à medicação estudada (Tabela 2). Outros eventos adversos leves relatados incluíram queimadura cardíaca transitória, palpitação cardíaca, constipação, dor torácica, febre, dermatite por radiação e sintomas de resfriado/fluores. As três doses foram bem toleradas, e os participantes não tiveram dificuldade em engolir até 9 cápsulas três vezes ao dia. É de notar que não foram relatados nem náuseas nem perturbações gastrointestinais; dois efeitos secundários foram relatados em ensaios clínicos anteriores de outros extractos de Tv.

3.2. Resposta Imune

O compartimento dos glóbulos vermelhos não foi afetado tanto pela Radioterapia (RT) como pela administração da TV. A contagem absoluta de eritrócitos, hemoglobina e hematócrito estavam normais na visita um, que foi no dia anterior ao início da RT, e continuou a cair dentro dos limites normais durante o resto do estudo. A contagem absoluta de glóbulos brancos e de neutrófilos estava geralmente dentro dos limites normais para todas as mulheres, tanto antes como depois da RT e durante as semanas após a RT enquanto estavam a tomar Tv (dados não mostrados). Entretanto, a contagem de linfócitos absolutos revelou um padrão diferente dos outros subconjuntos do hemograma. Como os critérios de elegibilidade foram idênticos nos estudos realizados pelos nossos centros desde 2006, para aumentar a potência, combinamos os dados do nosso estudo observacional (𝑁=14) que mostrou que a RT produziu defeitos imunológicos em mulheres com câncer de mama estágio I-III com o nosso estudo de escalonamento de dose atual (𝑁=9). Para o número combinado de 23 mulheres em ambos os estudos com estado de câncer de mama estágio I-III após cirurgia de mama e quimioterapia que depois receberam radioterapia, os linfócitos estavam dentro dos limites normais antes da RT, mas caíram para níveis anormalmente baixos após a RT. A contagem média de linfócitos para todos os 23 sujeitos antes da RT foi de 1,027±0,298 e caiu 20% após a RT para 0,681±0,254, uma diferença que foi estatisticamente significativa . No estudo de escalonamento da dose, as duas doses orais mais elevadas (6 e 9 g) de Tv resultaram numa recuperação mais precoce da contagem de linfócitos (Figura 2). O número de linfócitos recuperou gradualmente para o grupo observacional, mas a contagem média de linfócitos permaneceu abaixo da dos 6 e 9 gm de coortes da Tv às 6 semanas após a RT. Devido ao pequeno número para cada coorte de dose (𝑁=3), foi encontrada significância estatística apenas entre os grupos observacional e 9 g no ponto de tempo pós-tradioterapia de 2 semanas. A radioterapia deprimiu estatisticamente de forma significativa o número absoluto de linfócitos em mulheres com câncer de mama estágio I-III que completaram a cirurgia e a quimioterapia (ver Figura 2).

Atividade funcional das células assassinas naturais foi dramaticamente reduzida a partir do pré- para as 23 pacientes com câncer de mama que completaram as duas primeiras visitas do estudo observacional (𝑁=14) ou do estudo de aumento de dose (𝑁=9). A Figura 3 mostra que a actividade média das células NK era 19,941±18,959 antes da RT e diminuiu para 9,872±13,454 após a RT (𝑁=23). Este declínio foi estatisticamente significativo (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). Uma tendência ao aumento da atividade das células NK foi observada na coorte de dose de 6 g de Tv.

Com relação à contagem de células CD16+56+ NK, não foram observadas alterações significativas devido à radioterapia ou à administração de TV (Figura 6). Como a atividade das células NK foi diminuída pela RT e aumentada na coorte de dose de 6 gramas de Tv (Figura 3), mas as populações de células NK parecem não ser significativamente influenciadas por esses tratamentos, os dados sugerem que o aumento da atividade das células NK não é devido a alterações induzidas pelo tratamento no número de células NK. A população de células NK não foi afetada pela radioterapia ou por doses orais de TV (ver Figura 6).

4. Discussão

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Apesos deste estudo estabelecem a segurança da administração oral de uma preparação Trametes versicolor (Tv) em doses de 3, 6 e 9 gramas, sem eventos adversos graves desta terapia em mulheres após radioterapia para tratamento do câncer de mama. O estudo atual confirma nosso relatório anterior que a radioterapia padrão do peito para o câncer de mama não afeta o compartimento de glóbulos vermelhos ou neutrófilos, mas induz deficiências imunológicas específicas, incluindo linfopenia e atividade funcional das células NK deprimidas. As terapias celulares NK estão surgindo em todo o mundo como tratamentos anticancerígenos promissores, explorando a ação citolítica rápida dos agentes de efeito NK e sua aplicabilidade potencialmente ampla contra uma ampla gama de neoplasias malignas. Nossa nova descoberta é que a perda da atividade celular NK parece ser independente do número de células NK. Aqui, mostramos que o RT reduz a atividade das células NK por célula NK. Doses orais maiores de Tv a 6 e 9 gramas/dia foram associadas a uma recuperação mais rápida dos linfócitos e da atividade das células NK, bem como um aumento do número de células CD8+T e células CD19+B. Não houve efeito evidente da Tv no número de células CD 16+/56+ NK, apenas na sua actividade funcional. Embora haja uma tendência para doses mais altas de Tv com atividade imunológica mais pronunciada, este ensaio de escalonamento de dose fase I não foi projetado para avaliar mudanças dose-dependentes em marcadores imunológicos. Dados preliminares com estas pequenas amostras de 3 pacientes com câncer de mama por grupo de coorte de dose mostrando tendências relacionadas à dose levam à hipótese testável de que 6 gramas de Tv podem levar a uma recuperação imunológica mais rápida após a radioterapia. Os resultados deste ensaio fase I justificam e permanecem como a plataforma sobre a qual os ensaios aleatórios de dose controlada fase II podem prosseguir.

Embora este estudo tenha mostrado segurança de Trametes versicolor a uma dose diária de 9 gramas, o estudo de escalonamento de dose foi concebido para avaliar a dose máxima tolerada (MDT); portanto, este estudo não determinou a segurança e tolerabilidade na dose mais elevada. O recrutamento de mulheres em uma coorte de 12 gramas ou mais não foi alcançado devido a múltiplos fatores limitantes. Primeiro, as mulheres tiveram de cumprir critérios de elegibilidade muito rigorosos para se inscreverem no estudo e serem submetidas a cirurgia, quimioterapia e radiação no seu protocolo de tratamento. Atualmente, muitas mulheres com diagnóstico de câncer de mama não recebem um regime de terapia tripla. Muitas mulheres são diagnosticadas com câncer de mama estágio 1 e se submetem a lumpectomia e radiação, e se seu escore oncótipo é baixo, elas não recebem quimioterapia. Além disso, muitas mulheres foram recrutadas para outros estudos de pesquisa e foram saturadas com pedidos para se inscreverem em estudos adicionais. Mais importante ainda, descobrimos que as mulheres após completarem um longo regime de tratamento de quimioterapia e radiação estavam relutantes em participar de um estudo de nove semanas que exigiu seis visitas adicionais à Universidade.

Os dados da fase I sugerem que a TV é uma imunoterapia segura para pacientes com câncer de mama que pode corrigir defeitos imunológicos relacionados à radioterapia. Com base em nossos achados, a terapia com cogumelos da TV administrada oralmente no ambiente pós-tradioterapia pode aumentar o número de linfócitos e a atividade tumoricida das células NK. A recidiva após o tratamento primário do cancro da mama pode estar relacionada com defeitos no sistema imunitário inato e adaptativo. Pesquisas realizadas pelo nosso centro continuam a indicar que Trametes versicolor representa uma nova terapia imunológica com aplicações significativas no tratamento do câncer.

Aprovação Ética

Todos os experimentos realizados estão de acordo com as leis atuais dos EUA.

Conflito de interesses

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Acreditos

Este trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde/Centro Nacional de Medicina Complementar e Alternativa (U19 AT 1998) e do Gateway for Cancer Research Grant no. G-04-002. Os autores também agradecem o apoio editorial de Rebekah Pratt do departamento de medicina familiar da U do MN e Daniel Strenge por sua contribuição.