Observação de embriões fertilizados para embriões clivados
>
Desde que a primeira cultura de embriões de coelho foi descrita em 1912 e o zigoto de rato pôde ser cultivado in vitro para formar embriões em fase de blastocisto , A qualidade do embrião tornou-se um fator importante para a gravidez após a transferência do embrião in vitro para o útero, porque a qualidade do embrião tem uma estreita correlação com a implantação do embrião transferido no útero. Desde o nascimento do primeiro bebé de “tubo de ensaio”, Louise Brown em Julho de 1978, pelo qual o Prémio Nobel de Fisiologia ou Medicina 2010 foi atribuído a Robert Edwards por desenvolver fertilização in vitro (FIV) e transferência embrionária (ET) para tratar a infertilidade em mulheres com oviductos não patenteados, a produção embrionária in vitro (IVP) tem sido amplamente utilizada no tratamento da infertilidade humana e na reprodução e expansão da população animal. No entanto, o sucesso da tecnologia reprodutiva assistida depende principalmente da produção de embriões viáveis com alto potencial de implantação. Mais importante ainda, a escolha do melhor embrião para transferência tornou-se o maior desafio na FIV. Na cultura embrionária precoce, a avaliação da qualidade do embrião foi baseada principalmente nos critérios morfológicos do embrião transferido. Assim, realizar uma observação em série da morfologia embrionária é uma técnica comum para os embriologistas avaliarem os embriões e tem sido considerada como um preditor fundamental da implantação e da gravidez. A longo prazo, os embriologistas realizaram avaliações da qualidade e morfologia do embrião, retirando os embriões da incubadora e colocando-os sob um microscópio. Além da observação morfológica, os pesquisadores estão interessados em uma série de estudos sobre mudança nuclear celular, ativação e expressão gênica, expressão de proteínas citoplasmáticas, diferenciação de blastômeros, e assim por diante. No entanto, estes estudos frequentemente resultam na morte de embriões. Por exemplo, em nosso estudo inicial que observou mudança do micro fuso após a entrada dos espermatozóides no óvulo ou a ativação do oócito, os zigotos fertilizados ou óvulos ativados precisavam ser fixados na lâmina e corados com fluoresceína imunocitoquímica e microscopia confocal a laser . Nossa pesquisa mostrou claramente a alteração do microtubo e da cromatina após a ativação do oócito bovino e a injeção do espermatozóide introcitoplasmático (ICSI; Figura 1). O esperma em oócito ou ionóforo de cálcio e etanol pode ativar oócito e causar extrusão do segundo corpo polar. A fim de observar o tempo do segundo corpo polar, coramos vários estágios de oócitos após a ativação. O resultado mostrou que após 5 horas de pós-ativação, o segundo corpo polar pode ser completamente extrudado (Figura 2).
Figure 1.
Microscopia confocal de varredura de fuso e alterações cromatinosas nos vários tempos pós-ativação e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) em bovinos. Letras maiúsculas (Esquerda) indicam a alteração pós-ativação e letras pequenas (Direita) indicam após a ICSI. A/a mostrado a 0,5 h, B/b é 2 h, C/c é 3 h, e D/d é 7 h pós-ativação ou ICSI. Prenucleus no ovo ativado e prenuclei no ovo ICSI apareceram com a cor vermelha.
Figure 2.
Microscopia confocal de varredura do fuso e alterações cromatinosas nos vários momentos pós-ativação em bovinos. Em 0,5 h após a ativação, os cromossomos do fuso começam a se dividir, e a conclusão da divisão do fuso necessita de cerca de 3 horas e o segundo corpo polar pode ser extrudado em cerca de 5 horas. O vermelho e o verde juntos indicam o fuso, e o ponto vermelho indica o primeiro corpo polar.
O estudo da expressão gênica freqüentemente requer o isolamento do mRNA ou proteína dos embriões; portanto, os embriões precisam ser lisados e nenhum embrião sobreviveria. A fim de estudar a diferenciação celular em embriões em estágio moral e blastocisto, uma coloração dupla com método de microscopia de fluoresceína tem sido usada para distinguir a massa celular interna (MCI) do trofoectoderm (TE). Os números de duas células diferentes podem ser contados com base em cores diferentes (ICM como azul e TE como rosa, Figura 3).
Figure 3.
Distinguindo células diferentes em embriões blastocistos bovinos com coloração dupla. A figura superior mostra um embrião blastocisto com marcada massa celular interna (MCI) e ao redor de células tefctodérmicas (TE). A figura inferior mostra um embrião blastocisto bovino com coloração dupla, azul como MI e rosa como células TE. A figura em cima é da pesquisa na página web, e o autor agradece muito a cortesia do Prof. Fuliang Du pela foto inferior inédita.
Estes métodos de pesquisa finalmente danificam todos os embriões, e é impossível aplicar estes métodos à prática clínica. Assim, a actual avaliação da qualidade embrionária baseia-se principalmente nos critérios morfológicos dos embriões transferidos, que incluem três parâmetros principais, tais como a regularidade dos blastômeros, a fragmentação e a granularidade citoplasmática. Além disso, o número de células embrionárias em diferentes dias de cultura e multinuclearidade pode ser considerado para avaliar a qualidade embrionária . Vários relatórios têm documentado a associação entre as características morfológicas dos embriões em fase de clivagem com o sucesso da gravidez. Assim, este é atualmente o método básico para avaliação da qualidade embrionária na FIV humana e na produção de embriões de animais in vitro. No entanto, embora isto seja facilmente praticado, frequentemente retira embriões da incubadora, o que leva a preocupações com a segurança e estabilidade das condições de cultura. Além disso, alguns pontos-chave do desenvolvimento embrionário podem não ser observados durante a observação. A avaliação de embriões clivados durante a cultura e antes da transferência embrionária é uma prática clínica importante. Atualmente, a principal avaliação de embriões fertilizados in vitro é a observação visual através de microscopia. Nos últimos anos, várias incubadoras de microscopia com lapso de tempo estão sendo usadas na clínica de fertilização in vitro humana para monitorar todas as etapas de crescimento e desenvolvimento embrionário. Embora as tecnologias de diagnóstico e seleção de embriões pré-implantação (PGD/PGS) tenham sido aplicadas na prática da seleção de embriões humanos para melhorar a taxa de gravidez, estas técnicas são invasivas para os embriões. Encontrar outro método não-invasivo para selecionar um bom embrião será muito útil na prática do ART humano. Sallam et al. revisaram métodos não-invasivos para a seleção de embriões e avaliaram esses métodos à luz das melhores evidências atualmente disponíveis para descobrir se algum deles está maduro para substituir ou complementar o método de avaliação morfológica consagrado pelo tempo. Assim, precisamos de ferramentas mais poderosas para estimar os marcadores morfocinéticos dos embriões.
2.1. Morfocinética de clivagem de embriões baseada em imagens de time-lapse
Durante décadas, pesquisadores têm tentado acompanhar o desenvolvimento de organismos multicelulares a partir de óvulos fertilizados para adultos. Embora os cientistas tivessem explorado etapas individuais deste processo, não existia nenhum método que lhes permitisse modelar ao vivo todo o processo de desenvolvimento. Atualmente, os avanços em microscopia de luz relatados em dois jornais Nature Method permitiram aos pesquisadores visualizar o desenvolvimento precoce com grande detalhe. Microscópios de folhas de luz recentes usam uma folha de luz laser para iluminar uma seção fina de uma amostra e capturar o plano inteiro em um único instantâneo. Isto permite-lhes usar muito menos luz do que os microscópios confocais ou de dois fotões. É muito rápido, mas também muito suave, para ter um desempenho extremamente bom em várias formas críticas ao mesmo tempo. Para a imagiologia do desenvolvimento de embriões inteiros como os de Drosophila, zebrafish e ratos, esta nova técnica de imagem multiview é fantástica.
A imagem temporo-lapse é outra tecnologia não invasiva e emergente que permite o monitoramento 24 horas do desenvolvimento embrionário, oferecendo a possibilidade de aumentar a quantidade e qualidade da informação morfológica sem perturbar a condição da cultura. O microscópio temporo-lapse é muito útil para a observação do desenvolvimento embrionário. Na última década, muitas clínicas ou centros de FIV humana começaram a usar a imagem time-lapse para monitorar o crescimento e a divisão embrionária durante a cultura in vitro e finalmente para selecionar embriões de boa qualidade para transferência de acordo com dados e imagens registradas. Esta técnica tem sido relatada para ser capaz de melhorar a implantação e gravidez do embrião transferido. Com base no registro de lapso de tempo para clivagem embrionária, a velocidade normal de clivagem embrionária pode ser determinada. Assim, no segundo capítulo deste livro, o tempo de clivagem embrionária foi delineado com base em marcadores morfocinéticos pelo monitor de lapso de tempo. De acordo com este esboço de tempo de clivagem embrionária, os embriologistas podem saber claramente em que fase um embrião deve estar em vários pontos de tempo. Assim, um embrião de ótima qualidade ou um embrião de alto potencial de implantação pode ser selecionado para transferência para obter uma maior taxa de gravidez. Usando um sistema de registro de tempo contínuo e freqüente, alguns marcadores morfocinéticos podem ser revelados no sistema de lapso de tempo. Por exemplo, a rápida divisão das células embrionárias em um dado momento resulta frequentemente em menor taxa de implante. Na situação normal, a divisão do zigoto em 2-3 células requer cerca de 10-11 horas de tempo, mas Rubio et al. descobriram que alguns embriões apenas gastam cerca de 5 horas para completar esta divisão, e estes embriões têm uma taxa de implantação muito menor do que os embriões de divisão normal (1,2% vs 20%). Além disso, a clivagem desigual do embrião que é definida como uma abrupção de um blastômero em três blastômeros filhas ou um intervalo de ciclo celular inferior a 5 horas, muitas vezes produz um potencial de implantação significativamente menor. Assim, podemos usar estes marcadores morfocinéticos mais precisos para distinguir a qualidade embrionária.
O terceiro capítulo examina e verifica se a tecnologia de imagem time-lapse é útil para a seleção de embriões de “alta qualidade” para transferência, a fim de melhorar o resultado do ART, ao invés da avaliação morfológica convencional. Curiosamente, as possíveis correlações entre o sexo do embrião, fragmentação embrionária, protocolos de tratamento, diferentes meios de cultura e morfocinética embrionária têm sido avaliadas com base em algumas novas pesquisas sobre instalações de imagens com lapso de tempo. Além disso, vários algoritmos e modelos preditivos desenhados em ciclos de ART com imagens com lapso de tempo são também discutidos. Por exemplo, muitas pesquisas sobre a velocidade de desenvolvimento embrionário animal e humano pela observação da morfologia comum mostraram que embriões machos crescem mais rapidamente do que embriões fêmeas. No entanto, a observação por imagens com lapso de tempo pode fornecer mais detalhes e informações exatas sobre a diferença entre embriões machos e fêmeas durante as divisões iniciais. Embora os embriões femininos apresentassem clivagem tardia (t8), mórula (tM) e parâmetros morfocinéticos do estágio blastocístico, eles apresentaram expansão mais precoce do que os masculinos. Assim, os principais pontos de observação estão relacionados ao desenvolvimento do gênero embrionário. Curiosamente, os autores desenharam um modelo de acordo com o tempo de segunda sincronia e formação de mórula com quatro subgrupos para prever a probabilidade de um embrião ser do sexo feminino.
Para aprofundar o estudo e a exploração da morfocinética da clivagem embrionária, o quarto capítulo discute alguns métodos de análise espaço-temporal da clivagem embrionária in vitro.A análise automatizada ou semiautomática de imagens embrionárias em estágio inicial durante a fase de clivagem pode dar uma visão do tempo da mitose, da regularidade do tempo de divisão e do padrão, bem como da linhagem celular. O monitoramento simultâneo dos processos moleculares permite o estudo das conexões entre expressão genética e fisiologia e desenvolvimento celular. Através de dados de imagem com lapso de tempo e software analítico, uma sequência de vídeo tetradimensional de embriões pode ser facilmente criada para que os embriões em crescimento apresentem novos insights sobre o desenvolvimento do embrião temporal. Neste capítulo, os autores descrevem três métodos com variações na análise de hardware e software, dando alguns exemplos dos resultados para abrir uma janela para novas informações em embriologia do desenvolvimento, como padrão de divisão embrionária e linhagem são estudados in vivo.
2.2. Expressão gênica da clivagem embrionária e avaliação não-invasiva da viabilidade embrionária via análise dos meios de cultura
O desenvolvimento embrionário pré-implantatório experimenta uma série de eventos críticos e modificações epigenéticas notáveis, e a reprogramação da expressão gênica ocorre para ativar o genoma embrionário. Nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário pré-implantatório, os mRNAs maternos direcionam o desenvolvimento embrionário. Ao longo do desenvolvimento embrionário precoce, um padrão diferencial de metilação é mantido, embora alguns apresentem mudanças específicas de estágio. Estudos recentes mostraram que o processo de desmetilação diferencial resulta na expressão diferencial do gene parental nos embriões em desenvolvimento precoce que pode ter um impacto sobre o desenvolvimento correto . Também, RNAs não codificadores, RNAs longos não codificadores (lncRNA), e RNAs curtos não codificadores, microRNAs (miRNAs) têm demonstrado desempenhar um papel importante na regulação dos mRNAs e, portanto, seu papel no desenvolvimento pré-implantação ganhou importância. O capítulo cinco revisa os diferentes fatores que afetam a expressão gênica durante o desenvolvimento embrionário pré-implantatório, o que inclui fatores epigenéticos, enfocando os perfis de metilação, de gametas e embriões pré-implantados. Os efeitos dos RNAs não-codificadores na expressão gênica foram cuidadosamente avaliados.
Por causa do aparecimento da expressão gênica durante o desenvolvimento embrionário em cultura in vitro, os embriões pré-implantados freqüentemente requerem meios ricos de cultura nutricional. O embrião durante seu crescimento e desenvolvimento precisa absorver alguns componentes nutritivos importantes do meio de cultura e produzir metabolicamente alguns subprodutos como resultado da expressão gênica. Deste ponto de vista, a cultura in vitro de embriões também fornece um material muito importante para uma avaliação não invasiva do embrião através do exame de biomarcadores no meio de cultura embrionária gasto. Os métodos desenvolvidos actualmente concentram-se na medição de compostos metabólicos secretados do desenvolvimento embrionário. Estes estudos utilizam principalmente as ferramentas da análise moderna e da proteômica. Alguns estudos sugerem que o perfil metabólico dos meios de cultura embrionária utilizando espectroscopias ópticas e não ópticas pode fornecer um complemento útil às estratégias atuais de avaliação embrionária e fornecer uma visão do fenótipo de embriões com potencial reprodutivo crescente .
No sexto capítulo, os autores descrevem sua nova descoberta, a cadeia alfa-1 da molécula haptoglobina humana como um biomarcador quantitativo de viabilidade embrionária. Em uma série de experimentos retrospectivos, os cegos obtiveram mais de 50% de sucesso. Este capítulo resume as abordagens metabólicas e proteômicas atualmente disponíveis como a avaliação molecular não-invasiva da viabilidade embrionária. Estudos recentes mostraram que a avaliação dos componentes moleculares dos meios nutritivos é uma área promissora na busca dos marcadores de sucesso da implantação embrionária com o subsequente desenvolvimento de uma gravidez clínica e o nascimento de um bebê saudável para aumentar a eficiência do tratamento com técnicas ART. Se a composição molecular dos meios de cultivo puder ser usada como um procedimento adicional não invasivo para escolher um embrião para transferência seletiva, será muito útil para melhorar o resultado da gravidez humana FIV.