Análise neurogenética da desintegração infantil

Estudantes

Características clínicas da coorte CDD e o número de sujeitos examinados por cada modalidade de estudo são mostrados na Tabela 1. A proporção de sexo de 3,25 homens para 1 mulher é similar à relatada para a CIA. A média e a mediana da idade no início dos sintomas foi de 46 e 40 meses, respectivamente, com intervalo de 28 a 84 meses. Setenta por cento dos sujeitos experimentaram um prodrómio de ansiedade e terror. Trinta por cento dos sujeitos tiveram múltiplos episódios de regressão. A duração do primeiro episódio regressivo variou de 2 meses a quase 7 anos em um sujeito. A maioria dos sujeitos tem identificação severa a profunda, sendo o QI médio e mediano de 30 e 26, respectivamente, com um intervalo de 8 a 74. Todos tiveram perda de competências linguísticas, perda de competências sociais ou de comportamento adaptativo e perda de capacidades lúdicas. Sessenta e cinco por cento tinham perda de controlo do intestino ou da bexiga, e a mesma proporção tinha perda de capacidades motoras. Embora o CDD tenha sido relatado como sendo quase sempre esporádico, alguns dos nossos sujeitos têm membros da família imediata com ASD ou características autistas, incluindo dois conjuntos de gêmeos monozigóticos. Ambos os membros de um par (CDD13-03/04) têm CDD; no outro par (CDD20-03/04), um tem CDD e o outro tem ASD.

Genetics

Dada a raridade, severidade e transmissão aparentemente esporádica vista na maioria dos casos de CDD, colocamos a hipótese de que variantes raras de grande efeito contribuem para a etiologia. De fato, há abundantes evidências para a contribuição de variantes raras para a DDA. Como mostrado na Tabela 2, encontramos uma ou mais variantes raras para todas as probandas, exceto uma, que não foram compartilhadas por nenhum controle irmão não afetado (arquivo adicional 2: Tabela S2). Também procuramos por variantes heterozigotas compostas em sujeitos, procurando por variantes adicionais em genes afetados por variantes de novo, mas não encontramos nenhuma. As taxas de todas as altas probabilidades (Bayesian quality score ≥ 50) de novas variantes foram 0,80/exoma de banda e 0,92/exoma de banda (arquivo adicional 2: Tabela S3), que são semelhantes às taxas gerais calculadas a partir de 11 estudos recentes da WES sobre distúrbios do desenvolvimento neurológico: 1,00/exoma de banda, n = 2358; 0,82/exoma de controle, n = 731 . Não houve diferenças significativas nas taxas de variantes não-sinônimas de novo, homozigotos e hemizigotos (Arquivo adicional 2: Tabela S3); a taxa de genes afetados pela expressão cerebral; escores de conservação do valor filogenético P (PhyloP) em posições variantes; escores de Intolerância por Variação Residual (RVIS); e escores de fenótipo de polimorfismo v2 (PolyPhen-2) (Arquivo adicional 2: Tabela S2) entre os probandos e irmãos.

Encontramos um de novo genic CNV em uma proband (0,07/proband, Tabela 2), que é similar às taxas relatadas anteriormente para ASD , e nenhuma em irmãos. A probanda CNV é uma deleção heterozigótica de 2 kb do 3′UTR do OGDHL, que codifica um componente de um complexo proteico mitocondrial implicado na neurodegeneração. Um gene, SUPT20HL2, e duas famílias de genes, USP e BBS, são afetados em mais de uma probanda CDD. Duas variantes hemizigóticas foram identificadas no SUPT20HL2, que codifica um fator de transcrição putativo, mas poderia ser um pseudogene de acordo com a base de dados UniProtKB (http://www.uniprot.org/). Três membros da família do gene USP (peptidase específica da ubiquitina) são afetados nos probandos de CDD: USP9X (missense hemizígena), USP9Y (sem sentido paternal), e USP26 (missense hemizígena). Elas codificam enzimas desubiquitantes que impedem a degradação das proteínas. Dois membros da família genética Bardet-Biedel Syndrome (BBS), que está envolvida na ciliogênese, têm novas variantes de missens em probandos de CDD: BBS5 e BBS9. Embora as variantes específicas de mudança de proteínas identificadas nos indivíduos portadores de CDD fossem raras e não estavam previamente associadas à doença, revisamos a literatura e encontramos alguma sobreposição entre genes candidatos a CDD e genes potencialmente associados a outras doenças neurológicas (Tabela 2).

Não havia variantes claramente deletérias nas probandas de CDD. Para identificar variantes potencialmente patogênicas, consideramos uma combinação de fatores: (1) expressão cerebral positiva, (2) escore PhyloP ≥ 1,30 (P = 0,05 para conservação), (3) RVIS negativo (intolerante à variação genética), e (4) classificação PolyPhen-2 de provável falha prejudicial (ou n/a devido a uma variante que não seja falha). Dos 47 genes candidatos a CDD, 14 preenchiam todos estes critérios: NRK, TBC1D8B, TRRAP, NAV2, OGDHL, ZNF236, PRKCSH, MTMR8, BCOR, SRPK3, USP9Y, KIAA2018, CXorf57, e ALG13 (Tabela 2). Para refinar ainda mais esta lista, a inspeção dos dados de seqüenciamento do Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) revelou isso: (1) as variantes em todos os genes exceto NAV2, MTMR8, e ALG13 são novas ou encontradas no máximo uma vez no conjunto de dados e (2) entre os 11 genes restantes, 4 estão entre os 5% mais intolerantes: TRRAP, ZNF236, BCOR e KIAA2018.

TRRAP (proteína associada ao domínio de transformação/transcrição)afetado por uma variante de novo missense numa sonda CDD masculina; codifica um componente de complexos de acetyltransferase histonal e está envolvido na transcrição e reparação do DNA. Não está associada a uma desordem OMIM, mas foram identificadas novas variantes em outras desordens neurológicas (Tabela 2). ZNF236 (Zinc Finger Protein 236) também é afetado por uma variante de nova missense em uma sonda masculina; pode estar envolvido na regulação transcripcional (UniProtKB), mas não está associado a uma desordem conhecida. BCOR (BCL6 Corepressor) é afetado por uma variante de erro hemizigótico em uma sonda de CDD masculina; codifica um corepressor transcripcional. Está associado à microftalmia sindrômica, que pode ter a característica de identificação, mas não caracteriza a probanda CDD e é geralmente causado por mutações truncantes em fêmeas. O KIAA2018 é afetado por uma deleção de um aminoácido homozigoto em uma probanda CDD masculina; também é conhecido como USF3 (upstream transcription factor 3). Não está associado a uma desordem OMIM, mas foram identificadas novas variantes em outras desordens neurológicas (Tabela 2). De notar que todos estes genes candidatos de topo ou desempenham um papel ou podem estar envolvidos na transcrição, o que também caracteriza muitos genes associados à CDA .

Utilizando o conjunto de dados de transcriptoma exon-array BrainSpan humano, traçamos o nível de expressão mediana dos genes candidatos à CDD como um grupo para todas as regiões cerebrais disponíveis desde os estádios embrionários até ao final da idade adulta (n = 40 genes representados uma vez no conjunto da sonda central, Ficheiro adicional 2: Tabela S4). Como mostrado pelo perfil de expressão na Fig. 1, os genes candidatos a CDD são mais altamente expressos em regiões não-neocorticais do que em regiões neocorticais ao longo da vida (Arquivo adicional 2: Tabela S5). Além disso, há níveis crescentes de expressão no AMY, STR e HIP durante os períodos 10 (1-6 anos de idade) e 11 (6-12 anos de idade), a faixa que abrange a idade de início dos sintomas em nossa coorte CDD.

Dando esta observação, comparamos a diferença nos níveis de expressão mediana entre regiões não-neocorticais e neocorticais para genes afetados por variantes não-sinônimas e sinônimas em probandos CDD, seus irmãos não afetados, e probandos de ASD da Simons Simplex Collection (SSC), com e sem regressão, com e sem regressão, correspondendo por sexo, idade na avaliação, QI, e gravidade dos sintomas do autismo (ver arquivo adicional 1: Informação suplementar para detalhes de selecção da coorte). O perfil de expressão dos genes candidatos a CDD é qualitativamente distinto dos outros conjuntos de genes, excepto que é semelhante ao perfil dos genes afectados por variantes não sinónimas em probandos SSC com regressão, apesar de terem apenas um gene, NAV2, em comum (Fig. 2, Ficheiro adicional 2 : Tabelas S4 e S6). A diferença de expressão, não-neocortical menos neocortical, atinge um valor positivo máximo na fase média do feto. Para os genes candidatos a CDD, isso ocorre no período seis; testes de permutação com 100.000 iterações de 40 genes selecionados aleatoriamente do conjunto de dados BrainSpan confirmaram a significância dessa expressão diferencial (P = 0,0022). Estendemos a análise a vários outros conjuntos de genes, como aqueles identificados em probandos SSC e irmãos não afetados com variantes não-sinônimas, sinônimas e LGD; genes mais significativamente associados com ASD por três grandes estudos recentes de WES e CNV; e todos os genes do conjunto de dados BrainSpan. O perfil de expressão dos genes afetados por variantes não-sinônimas em probandos CDD e SSC com regressão é qualitativamente distinto desses outros conjuntos também (arquivo adicional 1: Figura S1, arquivo adicional 2: Tabelas S4 e S6).

Nós também investigamos se os genes candidatos a CDD são coexpressos uns com os outros. Dos 40 genes candidatos, 11 são coexpressos com pelo menos um outro gene candidato em todas as regiões e períodos de tempo do cérebro com um coeficiente de correlação de Pearson r ≥ 0,7 (Fig. 3, arquivo adicional 2: Tabela S7). Existem 23 dessas conexões, para uma média de 2,09 correlações/gene e um coeficiente médio de 0,779. O teste de permissão com 100.000 iterações de 40 genes selecionados aleatoriamente do conjunto de dados BrainSpan revelou que a observação de 11 genes com pelo menos 2,09 correlações/gene é significativa (P = 0,036), assim como a observação de 11 genes com um coeficiente médio de correlação de pelo menos 0,779 (P = 0,019). O cumprimento de ambos os limiares também é significativo (P = 0,0059). Como todos os 11 genes candidatos a CDD que são coexpressos entre si têm expressão cerebral positiva conforme o conjunto de dados do BrainSpan, o teste de permutação com 100.000 iterações também foi realizado com 40 genes de BrainSpan selecionados aleatoriamente. Enquanto a observação de 11 genes com pelo menos 2,09 correlação/gene não é significativa (P = 0,066), a observação de 11 genes com um coeficiente médio de correlação de pelo menos 0,779 é significativa (P = 0,022), assim como o cumprimento de ambos os limiares (P = 0,011). Comparando o conjunto de 11 genes candidatos a CDD coexpressos com o conjunto restante de 29 que não são coexpressos, não revelou diferenças significativas entre a taxa de genes coexpressos, escores PhyloP ou PolyPhen-2; entretanto, os genes coexpressos são significativamente mais intolerantes à variação (média RVIS -1,42 versus -0,15, t(35) = -2,91, P = 0,0062, teste t independente, bicaudal). Análise de enriquecimento ontológico de genes usando o Banco de Dados para Anotação, Visualização e Descoberta Integrada v6,8 (https://david.ncifcrf.gov/) para todo o conjunto de genes candidatos a CDD, e o subconjunto de 11 genes coexpressos não identificou enriquecimento significativo de termos GO após a correção dos valores de P de Benjamini-Hochberg.

Sistemas Neurais

Dada a universalidade dos déficits sociais na CIA, a disfunção nos sistemas cerebrais subservindo a percepção social, incluindo a percepção de rostos, é um foco chave da pesquisa da CIA. Os estímulos visuais faciais e caseiros ativam e dissociam de forma confiável os sistemas envolvidos no processamento de informações socioemocionais (rostos temerosos) e não-socioemocionais (casas). Estudamos quatro coortes: CDD (n = 7), LFASD (n = 7), HFASD (n = 14), e TD (n = 19). Embora os indivíduos com LFASD sejam mais numerosos que aqueles com CDD, nosso tamanho da amostra ainda foi limitado pela dificuldade de obter dados de neuroimagem (e rastreamento ocular) de alta qualidade em indivíduos com baixo funcionamento. Dito isto, para nosso conhecimento, esta é a primeira apresentação de dados de fMRI não sedados de indivíduos com DDA e identificação marcada.

Não houve diferenças significativas em sexo, idade, volume intracraniano e movimentação da cabeça no scanner entre os quatro coortes. Os grupos CDD e LFASD também não foram significativamente diferentes pelo QI e severidade do autismo, e os grupos HFASD e TD não foram significativamente diferentes pelo QI (arquivo adicional 2: Tabelas S8 e S9). Primeiro, utilizamos uma amostra de descoberta de 12 dos nossos 19 sujeitos TD em uma análise de todo o cérebro para uma localização independente das regiões de interesse envolvidas no processamento de faces relativas às casas. A Figura 4a ilustra regiões do córtex occipitotemporal ventrolateral onde os sujeitos TD exibiram faces significativas > ativação de casas (arquivo adicional 2: Tabela S10). Estas regiões incluíram as localizações esperadas dos nós conhecidos da rede occipitotemporal sensível à face, incluindo a área da face fusiforme e a área da face occipital. Como mostrado na Fig. 4b e no arquivo adicional 2: Tabela S11, a extração da porcentagem média de mudança de sinal (faces > casas) para cada um dos quatro grupos indicou uma ausência de diferenças de grupo na resposta a faces versus casas nestas regiões de interesse definidas independentemente quando comparando os grupos TD:validação e HFASD e quando comparando os grupos LFASD e CDD . A resposta das faces > no grupo CDD não foi significativamente maior que zero , sugerindo uma falta de sensibilidade geral para as faces na rede occipitotemporal face-sensitive como um todo. Há um achado bem estabelecido de hipoactivação das faces (versus casas) no giro fusiforme médio direito do HFASD em relação ao TD . Nós fomos capazes de replicar este achado em nossos coortes. Entretanto, a comparação das faces > atividade das casas em CDD em relação à TD não revelou diferença significativa , assim como a comparação dos grupos LFASD e TD (arquivo adicional 1: Figura S2 e arquivo adicional 2: Tabela S12).

Dada a possível falta de sensibilidade às faces no córtex occipitotemporal ventrolateral no CDD, realizamos em seguida uma avaliação do cérebro inteiro dos indivíduos CDD para localizar os substratos neuroanatômicos da percepção facial nesses indivíduos. Como ilustrado na Fig. 5a, os indivíduos portadores de CDD apresentaram faces > abriga atividade no giro frontal médio, giro pré-central, caudato (striatum), tálamo, hipocampo e cerebelo (arquivo adicional 2: Tabela S13). Estes se sobrepõem às regiões cerebrais determinadas como tendo os níveis mais altos de expressão do gene candidato a CDD (Fig. 1). Como mostrado na Fig. 5b e no arquivo adicional 2: Tabela S14, a comparação da porcentagem média de mudança do sinal (faces > casas) dessas regiões de interesse revelou uma diferença significativa entre CDD e HFASD , mas nenhuma diferença significativa entre CDD e LFASD . O grupo LFASD mostrou um fenótipo intermediário ao dos grupos HFASD e CDD (Fig. 5b).

Comportamento do olhar

Coletamos dados de rastreamento ocular para quantificar o fenótipo social de nossos quatro coortes enquanto eles visualizavam faces emocionais . Como mostrado no arquivo adicional 2: Tabelas S15 e S16, os grupos não foram significativamente diferentes por sexo, idade e duração total da fixação na imagem. Os grupos CDD e LFASD também não foram significativamente diferentes pelo QI e severidade do autismo, e os grupos HFASD e TD não foram significativamente diferentes pelo QI. Como mostrado na Fig. 6, replicamos os achados anteriores de menor fixação nos olhos e maior fixação na boca no HFASD em relação ao TD. Entretanto, enquanto a porcentagem de tempo que os indivíduos com LFASD passaram olhando para os olhos não diferiu significativamente do grupo com HFASD, os indivíduos com CDD fixaram os olhos significativamente mais do que o grupo com HFASD. Comparados entre si, os indivíduos com DDC e DDAF não diferiram significativamente no tempo gasto a olhar para os olhos. Como nos resultados da fMRI (Fig. 5b), o grupo LFASD mostrou um fenótipo intermediário ao dos grupos HFASD e CDD (relação olho-boca, arquivo adicional 2: Tabela S16).