Ogólnie, trzy podstawowe właściwości związków chemicznych mogą być użyte do tworzenia rozdziałów HPLC. Są to:
– polarność
– ładunek elektryczny
– wielkość cząsteczki
Najpierw rozważmy polarność i dwa podstawowe tryby rozdzielania wykorzystujące tę cechę: chromatografię fazy normalnej i odwróconej.
Rozdzielanie na podstawie polarności
Struktura cząsteczki, jej aktywność i właściwości fizykochemiczne są określane przez rozmieszczenie atomów składowych i wiązań między nimi. W obrębie cząsteczki, specyficzny układ niektórych atomów, który jest odpowiedzialny za specjalne właściwości i przewidywalne reakcje chemiczne, nazywany jest grupą funkcyjną. Struktura ta często decyduje o tym, czy cząsteczka jest polarna czy niepolarna. Cząsteczki organiczne są podzielone na klasy zgodnie z podstawowymi grupami funkcyjnymi, które każda z nich zawiera. Stosując tryb rozdzielania oparty na polarności, względna retencja chromatograficzna różnych rodzajów cząsteczek jest w dużym stopniu określona przez charakter i położenie tych grup funkcyjnych. Jak pokazano na rysunku P, klasy cząsteczek można uporządkować na podstawie ich względnej retencji w zakresie lub spektrum polarności chromatograficznej od wysoce polarnej do wysoce niepolarnej.
Figura P: Spektrum polarności chromatograficznej według grupy funkcyjnej analitu
Woda jest związkiem polarnym. Benzen jest związkiem niepolarnym. Cząsteczki o podobnej polarności chromatograficznej mają tendencję do przyciągania się do siebie; te o odmiennej polarności wykazują znacznie słabsze przyciąganie, jeśli w ogóle, a nawet mogą się odpychać. Staje się to podstawą chromatograficznych trybów separacji opartych na polarności.
Innym sposobem myślenia o tym jest znana analogia: olej i woda nie mieszają się. Inaczej niż w magnetyzmie, gdzie przeciwne bieguny przyciągają się nawzajem, separacje chromatograficzne oparte na polarności zależą od silniejszego przyciągania między podobnymi i słabszego przyciągania między przeciwieństwami. Pamiętaj, „Podobne przyciąga podobne” w chromatografii opartej na polarności.
Rysunek Q: Odpowiednia kombinacja faz ruchomych i stacjonarnych wpływa na rozdzielanie oparte na polarności
Aby zaprojektować system rozdzielania chromatograficznego , tworzymy konkurencję dla różnych związków zawartych w próbce poprzez wybór fazy ruchomej i fazy stacjonarnej o różnych polarnościach. Wtedy związki w próbce, które są podobne w polarności do fazy stacjonarnej będą opóźnione, ponieważ są silniej przyciągane do cząsteczek. Związki, których polarność jest podobna do polarności fazy ruchomej będą preferencyjnie przyciągane do niej i będą poruszać się szybciej.
W ten sposób, w oparciu o różnice we względnym przyciąganiu każdego związku do każdej fazy, tworzy się separację poprzez zmianę prędkości analitów.
Rysunki R-1, R-2, i R-3 wyświetlają typowe chromatograficzne zakresy polarności odpowiednio dla faz ruchomych, faz stacjonarnych i analitów próbki. Rozważmy każdą z nich po kolei, aby zobaczyć, w jaki sposób chromatograf wybiera odpowiednie fazy, aby rozwinąć konkurencję przyciągania potrzebną do osiągnięcia rozdzielenia HPLC opartego na polarności.
Rysunek R-1: Spektrum polarności chromatograficznej fazy ruchomej
Skala, taka jak przedstawiona na rysunku R-1, na której niektóre powszechne rozpuszczalniki są umieszczone w kolejności względnej polarności chromatograficznej, jest nazywana serią eluotropową. Cząsteczki fazy ruchomej, które skutecznie konkurują z cząsteczkami analitów o atrakcyjne miejsca w fazie stacjonarnej, wypierają te anality, powodując ich szybsze przemieszczanie się przez kolumnę. Woda jest na polarnym końcu skali rozpuszczalnik-faza ruchoma, podczas gdy heksan, węglowodór alifatyczny, jest na niepolarnym końcu. Pomiędzy nimi, pojedyncze rozpuszczalniki, jak również mieszające się mieszaniny rozpuszczalników, mogą być umieszczone w kolejności siły elucji. To, który koniec skali reprezentuje „najmocniejszą” fazę ruchomą, zależy od charakteru powierzchni fazy stacjonarnej, na której występuje konkurencja o cząsteczki analitu.
Rysunek R-2: Spektrum polarności cząsteczek fazy stacjonarnej w chromatografii
Krzemionka ma aktywną, hydrofilową powierzchnię zawierającą kwaśne silanolowe grupy funkcyjne. W związku z tym, znajduje się na polarnym końcu skali fazy stacjonarnej przedstawionej na Rysunku R-2. Aktywność lub polarność powierzchni krzemionki można selektywnie modyfikować poprzez chemiczne wiązanie z nią mniej polarnych grup funkcyjnych. Przykłady pokazane tutaj obejmują, w kolejności malejącej polarności, odmiany cyjanopropylosililowe, n-oktylosililowe i n-oktadecylosililowe na krzemionce. Ta ostatnia jest hydrofobowym, bardzo niepolarnym upakowaniem.
Rysunek R-3: Spektrum polarności chromatograficznej związku/analitu
Rysunek R-3 powtarza spektrum polarności chromatograficznej naszej próbki . Po rozważeniu polarności obu faz, następnie, dla danej fazy stacjonarnej, chromatograf musi wybrać fazę ruchomą, w której interesujące go anality są zatrzymywane, ale nie tak silnie, aby nie mogły być eluowane. Wśród rozpuszczalników o podobnej sile chromatograf rozważa, która kombinacja faz może najlepiej wykorzystać bardziej subtelne różnice w polarności i rozpuszczalności analitów, aby zmaksymalizować selektywność systemu chromatograficznego. Podobne przyci±ga podobne, ale jak zapewne można sobie wyobrazić z dotychczasowej dyskusji, tworzenie rozdziału opartego na polarno¶ci wymaga znajomo¶ci próbki i do¶wiadczenia z różnymi rodzajami analitów i trybami retencji. Podsumowując, chromatograf wybierze najlepszą kombinację fazy ruchomej i cząsteczkowej fazy stacjonarnej o odpowiednio przeciwnych polaryzacjach. Następnie, jak analitów próbki poruszać się przez kolumnę, zasada jak przyciąga jak określi, które analitów spowolnić i które postępują z większą prędkością.
Normal-Phase HPLC
W jego separacji ekstraktów roślinnych, Tswett był udany przy użyciu polarnej fazy stacjonarnej z dużo mniej polarne fazy ruchomej. Ten klasyczny sposób chromatografii stał się znany jako faza normalna.
Rysunek S-1: Chromatografia fazy normalnej
Rysunek S-1 przedstawia chromatograficzną separację fazy normalnej naszej trójbarwnej mieszaniny testowej. Faza stacjonarna jest polarna i najsilniej zatrzymuje polarny żółty barwnik. Względnie niepolarny niebieski barwnik jest wygrywany w konkurencji retencji przez fazę ruchomą, niepolarny rozpuszczalnik, i szybko eluuje. Ponieważ niebieski barwnik jest najbardziej podobny do fazy ruchomej, przemieszcza się szybciej. Typowe dla chromatografii w normalnej fazie na krzemionce jest to, że faza ruchoma jest w 100% organiczna; nie używa się wody.
HPLC w odwróconej fazie
Termin odwrócona faza opisuje tryb chromatografii, który jest przeciwieństwem normalnej fazy, a mianowicie użycie polarnej fazy ruchomej i niepolarnej fazy stacjonarnej. Rysunek S-2 ilustruje czarną mieszaninę trzech barwników rozdzielaną przy użyciu takiego protokołu.
Rysunek S-2: Chromatografia odwróconej fazy
Teraz najsilniej zatrzymanym związkiem jest bardziej niepolarny niebieski barwnik, ponieważ jego przyciąganie do niepolarnej fazy stacjonarnej jest największe. Polarny żółty barwnik, będąc słabo zatrzymanym, jest wygrywany w konkurencji przez polarną, wodną fazę ruchomą, porusza się najszybciej przez złoże i eluuje najwcześniej jak przyciąga podobne.
Dzisiaj, ponieważ jest bardziej powtarzalny i ma szerokie zastosowanie, chromatografia odwróconej fazy jest używana w około 75% wszystkich metod HPLC. Większość z tych protokołów wykorzystuje jako fazę ruchomą wodną mieszankę wody z mieszalnym, polarnym rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak acetonitryl lub metanol. Zazwyczaj zapewnia to właściwą interakcję analitów z niepolarną, hydrofobową powierzchnią cząstek. Krzemionka o wiązaniu C18 jest najbardziej popularnym typem opakowania HPLC z odwróconą fazą.
Tabela C przedstawia podsumowanie charakterystyki fazy dla dwóch głównych trybów rozdzielania HPLC opartych na polarności. Należy pamiętać, że dla tych trybów opartych na polarności, podobne przyciąga podobne.
Tabela C: Charakterystyka fazy w przypadku rozdzielania na podstawie polarności
Chromatografia hydrofilowa z interakcją
HILIC może być postrzegana jako odmiana chromatografii normalnej fazy. W chromatografii normalnofazowej faza ruchoma jest w 100% organiczna. Tylko śladowe ilości wody są obecne w fazie ruchomej i w porach polarnych cząstek upakowania. Polarne anality silnie wiążą się z polarną fazą stacjonarną i mogą nie eluować.
Dodanie pewnej ilości wody do organicznej fazy ruchomej umożliwia rozdzielenie i elucję związków polarnych, które są silnie zatrzymywane w trybie normalnej fazy. Woda, bardzo polarny rozpuszczalnik, skutecznie konkuruje z polarnymi analitami o fazę stacjonarną. HILIC może być prowadzony w trybie elucji izokratycznej lub gradientowej. Związki polarne, które są początkowo przyciągane do polarnych cząstek materiału wypełniającego, mogą być wymywane w miarę zwiększania polarności fazy ruchomej. Anality są wymywane w kolejności rosnącej hydrofilowości. Bufory lub sole mogą być dodawane do fazy ruchomej w celu utrzymania analitów jonizowalnych w jednej postaci.
Chromatografia hydrofobowo-interakcyjna
HIC jest rodzajem chromatografii w odwróconej fazie, która jest stosowana do rozdzielania dużych biomolekuł, takich jak białka. Zwykle pożądane jest utrzymanie tych cząsteczek w stanie nienaruszonym w roztworze wodnym, unikając kontaktu z rozpuszczalnikami organicznymi lub powierzchniami, które mogłyby je denaturować. HIC wykorzystuje hydrofobowe oddziaływanie dużych cząsteczek z umiarkowanie hydrofobową fazą stacjonarną, np. krzemionką z wiązaniami butylowymi, a nie krzemionką z wiązaniami oktadecylowymi. Początkowo, wyższe stężenie soli w wodzie będzie zachęcać białka do zatrzymania na opakowaniu. Separacje gradientowe są zwykle prowadzone poprzez zmniejszanie stężenia soli. W ten sposób biomolekuły są eluowane w kolejności wzrastającej hydrofobowości.
Separations Based on Charge: Ion-Exchange Chromatography
Dla separacji opartych na polarności, podobne przyciąga podobne, a przeciwieństwa mogą być odpychane. W chromatografii jonowymiennej i innych separacjach opartych na ładunku elektrycznym, zasada jest odwrotna. Podobieństwa mogą się odpychać, podczas gdy przeciwieństwa są do siebie przyciągane. Fazy stacjonarne do separacji jonowymiennych charakteryzują się charakterem i siłą funkcji kwasowych lub zasadowych na ich powierzchniach oraz rodzajem jonów, które przyciągają i zatrzymują. Wymiana kationowa jest stosowana do zatrzymywania i rozdzielania dodatnio naładowanych jonów na ujemnej powierzchni. I odwrotnie, wymiana anionowa jest używana do zatrzymywania i oddzielania ujemnie naładowanych jonów na dodatniej powierzchni. W przypadku każdego typu wymiany jonowej istnieją co najmniej dwa ogólne podejścia do separacji i elucji.
Rysunek T: Chromatografia jonowymienna
Silne wymieniacze jonowe posiadają grupy funkcyjne, które są zawsze zjonizowane. Są one zwykle używane do zatrzymywania i rozdzielania słabych jonów. Te słabe jony mogą być wymywane przez wypieranie fazą ruchomą zawierającą jony, które są silniej przyciągane do miejsc fazy stacjonarnej. Alternatywnie, słabe jony mogą być zatrzymywane na kolumnie, a następnie neutralizowane przez in situ zmianę pH fazy ruchomej, powodując ich utratę przyciągania i elucję.
Słabe wymieniacze jonowe mogą być neutralizowane powyżej lub poniżej pewnej wartości pH i tracą zdolność do zatrzymywania jonów przez ładunek. Kiedy są naładowane, są one używane do zatrzymywania i oddzielania silnych jonów. Jeżeli jony te nie mogą być eluowane przez przemieszczenie, wówczas miejsca wymiany w fazie stacjonarnej mogą zostać zneutralizowane, wyłączając przyciąganie jonowe i umożliwiając elucję naładowanych analitów.
Tabela D: Wytyczne dotyczące wymiany jonowej
Gdy słabe wymieniacze jonowe są zneutralizowane, mogą zatrzymywać i rozdzielać gatunki przez oddziaływania hydrofobowe lub hydrofilowe; w tych przypadkach siła elucji jest określona przez polarność fazy ruchomej . Tak więc, słabe wymieniacze jonowe mogą być stosowane do separacji w trybie mieszanym .
Tabela D przedstawia wytyczne dla głównych kategorii wymiany jonowej. Na przykład, aby zatrzymać silnie zasadowy analit , należy użyć słabo kationowymiennej cząsteczki fazy stacjonarnej przy pH > 7; zapewnia to ujemnie naładowaną powierzchnię cząsteczki. Aby uwolnić lub wymyć silną zasadę, należy obniżyć pH fazy ruchomej poniżej 3; powoduje to usunięcie ładunku powierzchniowego i wyłączenie jonowymiennego mechanizmu zatrzymywania.
Należy pamiętać, że pKa jest wartością pH, przy której 50% grupy funkcyjnej jest zjonizowane, a 50% jest obojętne. Aby zapewnić zasadniczo neutralny lub w pełni naładowany analit lub powierzchnię cząsteczki, pH musi być dostosowane do wartości co najmniej 2 jednostki poza pKa, odpowiednio .
Nie należy używać silnego wymiennika kationowego do zatrzymania silnej zasady; oba pozostają naładowane i silnie przyciągają się do siebie, co czyni zasadę prawie niemożliwą do wymycia. Można ją usunąć tylko przez zalanie silnego wymieniacza kationowego konkurencyjną zasadą, która wykazuje jeszcze silniejszą retencję i wypiera związek zainteresowania, wygrywając rywalizację o aktywne miejsca wymiany. Takie podejście rzadko jest praktyczne lub bezpieczne w HPLC i SPE.
Separacje oparte na wielkości: Size-Exclusion Chromatography –
W latach 50. XX wieku Porath i Flodin odkryli, że biomolekuły można rozdzielać na podstawie ich wielkości, a nie ładunku lub polarności, przepuszczając je lub filtrując przez hydrofilowy polimer dekstranu o kontrolowanej porowatości. Proces ten określono mianem filtracji żelowej. Później, analogiczny schemat został zastosowany do rozdzielania syntetycznych oligomerów i polimerów przy użyciu organiczno-polimerowych pakietów o określonym zakresie wielkości porów. Proces ten nazwano chromatografią żelowo-permeacyjną. Podobne rozdzielanie przy użyciu upakowań krzemionkowych o kontrolowanej porowatości nazwano chromatografią wykluczania rozmiaru. Wprowadzone w 1963 roku, pierwsze komercyjne instrumenty HPLC zostały zaprojektowane do zastosowań GPC .
Wszystkie te techniki są zazwyczaj wykonywane na fazach stacjonarnych, które zostały zsyntetyzowane z rozkładem wielkości porów w zakresie, który pozwala analitom zainteresowania wejść lub zostać wykluczonym z większej lub mniejszej części objętości porów w opakowaniu. Mniejsze cząsteczki penetrują więcej porów podczas ich przechodzenia przez złoże. Większe cząsteczki mogą penetrować tylko pory powyżej pewnego rozmiaru, więc spędzają mniej czasu w złożu. Największe cząsteczki mogą być całkowicie wykluczone z porów i przechodzić tylko pomiędzy cząsteczkami, eluując bardzo szybko w małej objętości. Fazy ruchome są wybierane z dwóch powodów: po pierwsze, są dobrymi rozpuszczalnikami dla analitów; a po drugie, mogą zapobiegać wszelkim interakcjom pomiędzy analitami a powierzchnią fazy stacjonarnej. W ten sposób większe cząsteczki eluują jako pierwsze, podczas gdy mniejsze cząsteczki poruszają się wolniej i eluują później, w porządku malejącym według ich wielkości w roztworze. Stąd prosta zasada: Duże cząsteczki wychodzą pierwsze.
Ponieważ możliwe jest skorelowanie masy cząsteczkowej polimeru z jego rozmiarem w roztworze, GPC zrewolucjonizowała pomiar rozkładu masy cząsteczkowej polimerów, który z kolei określa właściwości fizyczne, które mogą poprawić lub pogorszyć przetwarzanie polimerów, jakość i wydajność.
Wniosek
.