In het algemeen kunnen drie primaire kenmerken van chemische verbindingen worden gebruikt om HPLC scheidingen te maken. Deze zijn:
– Polariteit
– Elektrische lading
– Moleculaire grootte
Laten we eerst eens kijken naar polariteit en de twee primaire scheidingswijzen die dit kenmerk benutten: normale fase en reversed-phase chromatografie.
Scheidingen op basis van polariteit
De structuur, activiteit en fysisch-chemische eigenschappen van een molecuul worden bepaald door de rangschikking van zijn samenstellende atomen en de bindingen tussen hen. Binnen een molecuul wordt een specifieke rangschikking van bepaalde atomen, die verantwoordelijk is voor speciale eigenschappen en voorspelbare chemische reacties, een functionele groep genoemd. Deze structuur bepaalt vaak of het molecuul polair of apolair is. Organische moleculen worden in klassen ingedeeld op basis van de belangrijkste functionele groep(en) die ze bevatten. Bij gebruik van een scheidingsmethode op basis van polariteit wordt de relatieve chromatografische retentie van verschillende soorten moleculen grotendeels bepaald door de aard en de plaats van deze functionele groepen. Zoals figuur P laat zien, kunnen de klassen moleculen aan de hand van hun relatieve retentie worden gerangschikt in een reeks of spectrum van chromatografische polariteit, van zeer polair tot zeer apolair.
Figuur P: Chromatografisch polariteitsspectrum per functionele groep van de analyt
Water is een polaire verbinding. Benzeen is een apolaire verbinding. Moleculen met een vergelijkbare chromatografische polariteit hebben de neiging elkaar aan te trekken; die met een verschillende polariteit hebben een veel zwakkere aantrekkingskracht, zo die er al is, en kunnen elkaar zelfs afstoten. Dit wordt de basis voor chromatografische scheidingswijzen gebaseerd op polariteit.
Een andere manier om hieraan te denken is door de bekende analogie: olie en water mengen niet. Anders dan bij magnetisme, waar tegengestelde polen elkaar aantrekken, zijn chromatografische scheidingen op basis van polariteit afhankelijk van de sterkere aantrekkingskracht tussen gelijken en de zwakkere aantrekkingskracht tussen tegengestelden. Denk eraan: “Soort zoekt soort” in chromatografie op basis van polariteit.
Figuur Q: De juiste combinatie van mobiele en stationaire fasen beïnvloedt de scheiding op basis van polariteit
Om een chromatografisch scheidingssysteem te ontwerpen, creëren we concurrentie voor de verschillende verbindingen in het monster door een mobiele fase en een stationaire fase met verschillende polariteiten te kiezen. Dan zullen verbindingen in het monster die qua polariteit vergelijkbaar zijn met de stationaire fase worden vertraagd omdat zij sterker worden aangetrokken door de deeltjes. Verbindingen waarvan de polariteit vergelijkbaar is met die van de mobiele fase, zullen bij voorkeur worden aangetrokken en sneller bewegen.
Op deze manier wordt op basis van verschillen in de relatieve aantrekkingskracht van elke verbinding op elke fase een scheiding gecreëerd door de snelheden van de analyten te veranderen.
Figuren R-1, R-2 en R-3 tonen typische chromatografische polariteitsbereiken voor respectievelijk mobiele fasen, stationaire fasen en monsteranalyten. Laten we ze eens stuk voor stuk bekijken om te zien hoe een chromatograaf de juiste fasen kiest om de aantrekkingscompetitie te ontwikkelen die nodig is om een op polariteit gebaseerde HPLC-scheiding tot stand te brengen.
Figuur R-1: Chromatografisch polariteitsspectrum van de mobiele fase
Een schaal, zoals die in figuur R-1, waarop enkele veelgebruikte oplosmiddelen in volgorde van relatieve chromatografische polariteit worden geplaatst, wordt een eluotrope reeks genoemd. Mobiele-fasemoleculen die effectief concurreren met analytmoleculen voor de aantrekkelijke stationaire-faseplaatsen verdringen deze analyten, waardoor ze sneller door de kolom bewegen. Water staat aan het polaire uiteinde van de mobiele-fase-vloeistofschaal, terwijl hexaan, een alifatische koolwaterstof, aan het apolaire uiteinde staat. Daartussenin kunnen afzonderlijke oplosmiddelen en mengsels van mengbare oplosmiddelen worden geplaatst in volgorde van hun elutievermogen. Welk uiteinde van de schaal de “sterkste” mobiele fase vertegenwoordigt, hangt af van de aard van het oppervlak van de stationaire fase waar de concurrentie om de analysemoleculen plaatsvindt.
Figuur R-2: Chromatografisch polariteitspectrum van stationaire-fase-deeltjes
Silica heeft een actief, hydrofiel oppervlak dat zure silanol-functiegroepen bevat. Bijgevolg valt het aan het polaire uiteinde van de stationaire-fase-schaal die in figuur R-2 wordt getoond. De activiteit of polariteit van het silica-oppervlak kan selectief worden gewijzigd door er minder polaire functionele groepen chemisch aan te binden. Voorbeelden hiervan zijn, in volgorde van afnemende polariteit, cyanopropylsilyl- , n-octylsilyl- , en n-octadecylsilyl- groepen op silica. Deze laatste is een hydrofobe, zeer apolaire pakking.
Figuur R-3: Chromatografisch polariteitsspectrum stof/analysator
Figuur R-3 geeft een herhaling van het chromatografisch polariteitsspectrum van ons monster. Na beschouwing van de polariteit van beide fasen moet een chromatograaf dus voor een gegeven stationaire fase een mobiele fase kiezen waarin de te onderzoeken analyten worden tegengehouden, maar niet zo sterk dat ze niet kunnen worden geëlueerd. Tussen oplosmiddelen van vergelijkbare sterkte bekijkt de chromatograaf welke fasecombinatie de subtielere verschillen in polariteit en oplosbaarheid van de analyten het best kan benutten om de selectiviteit van het chromatografische systeem te maximaliseren. Soort zoekt soort, maar zoals u zich waarschijnlijk wel kunt voorstellen uit de discussie tot nu toe, vereist het maken van een scheiding op basis van polariteit kennis van het monster en ervaring met verschillende soorten analyten en retentiewijzen. Samengevat kiest de chromatograaf de beste combinatie van een mobiele fase en een stationaire deeltjesfase met de juiste tegengestelde polariteiten. Terwijl de analyten door de kolom bewegen, bepaalt de regel “gelijk trekt gelijk aan” welke analyten vertragen en welke sneller gaan.
Normal-Phase HPLC
In zijn scheidingen van plantenextracten was Tswett succesvol met het gebruik van een polaire stationaire fase met een veel minder polaire mobiele fase. Deze klassieke wijze van chromatografie werd bekend als normale fase.
Figuur S-1: Chromatografie in normale fase
Figuur S-1 geeft een normale-fase chromatografische scheiding weer van ons drie-kleuren-testmengsel. De stationaire fase is polair en houdt de polaire gele kleurstof het sterkst vast. De relatief apolaire blauwe kleurstof wordt in de retentiewedstrijd gewonnen door de mobiele fase, een apolair oplosmiddel, en elueert snel. Aangezien de blauwe kleurstof het meest lijkt op de mobiele fase, beweegt deze sneller. Typisch voor normale-fase chromatografie op silica is dat de mobiele fase 100% organisch is; er wordt geen water gebruikt.
Reversed-Phase HPLC
De term reversed-phase beschrijft de chromatografiewijze die precies het tegenovergestelde is van normale fase, namelijk het gebruik van een polaire mobiele fase en een niet-polaire stationaire fase. Figuur S-2 illustreert de scheiding van het zwarte mengsel van drie kleurstoffen volgens een dergelijk protocol.
Figuur S-2: Omgekeerde-fasechromatografie
Nu is de sterkst vastgehouden verbinding de meer apolaire blauwe kleurstof, aangezien de aantrekkingskracht daarvan op de apolaire stationaire fase het grootst is. De polaire gele kleurstof, die zwak wordt vastgehouden, concurreert met de polaire, waterige mobiele fase, beweegt het snelst door het bed en elueert het snelst, omdat gelijken elkaar aantrekken.
Omdat reversed phase-chromatografie reproduceerbaarder is en een brede toepasbaarheid heeft, wordt deze tegenwoordig voor ongeveer 75% van alle HPLC-methoden gebruikt. De meeste van deze protocollen gebruiken als mobiele fase een waterig mengsel van water en een mengbaar polair organisch oplosmiddel, zoals acetonitril of methanol. Dit zorgt meestal voor een goede interactie van de analyten met het apolaire, hydrofobe deeltjesoppervlak. Een C18-gebonden silica is het meest populaire type reversed-phase HPLC-verpakking.
Tabel C geeft een overzicht van de fasekenmerken voor de twee voornaamste HPLC-scheidingswijzen op basis van polariteit. Onthoud dat voor deze op polariteit gebaseerde scheidingswijzen geldt: “Soort zoekt soort”.
Tabel C: Fase-eigenschappen voor scheidingen op basis van polariteit
Hydrofiele-interactiechromatografie
HILIC kan worden gezien als een variant van normale-fasechromatografie. Bij normale-fase-chromatografie bestaat de mobiele fase voor 100% uit organische stoffen. Alleen sporen van water zijn aanwezig in de mobiele fase en in de poriën van de polaire pakkingdeeltjes. Polaire analyten binden sterk aan de polaire stationaire fase en elueren mogelijk niet.
Een beetje water toevoegen aan de organische mobiele fase maakt het mogelijk polaire verbindingen die sterk worden tegengehouden in de normale-fase modus te scheiden en te elueren. Water, een zeer polair oplosmiddel, concurreert effectief met polaire analyten om de stationaire fase. HILIC kan zowel in isocratische als in gradiënt-elutie worden uitgevoerd. Polaire verbindingen die aanvankelijk worden aangetrokken door de polaire pakkingstofdeeltjes, kunnen worden geëlueerd naarmate de polariteit van de mobiele fase toeneemt. Analyten worden geëlueerd in volgorde van toenemende hydrofiliteit. Buffers of zouten kunnen aan de mobiele fase worden toegevoegd om ioniseerbare analyten in één vorm te houden.
Hydrofobe-interactiechromatografie
HIC is een type omgekeerde-fase chromatografie dat wordt gebruikt voor het scheiden van grote biomoleculen, zoals eiwitten. Het is gewoonlijk wenselijk om deze moleculen intact te houden in een waterige oplossing, waarbij contact met organische oplosmiddelen of oppervlakken die hen zouden kunnen denatureren, wordt vermeden. HIC maakt gebruik van de hydrofobe interactie van grote moleculen met een matig hydrofobe stationaire fase, bijvoorbeeld butylgebonden siliciumdioxide in plaats van octadecylgebonden siliciumdioxide. In het begin zullen hogere zoutconcentraties in het water ertoe leiden dat de eiwitten op de pakking worden vastgehouden. Gradiënte scheidingen worden meestal uitgevoerd met afnemende zoutconcentratie. Op deze wijze worden biomoleculen geëlueerd in volgorde van toenemende hydrofobiciteit.
Separaties op basis van Charge: Ion-Exchange Chromatography
Bij scheidingen op basis van polariteit wordt soortgelijk aangetrokken door soortgelijk en kunnen tegengestelden worden afgestoten. Bij ionenwisselingschromatografie en andere scheidingen op basis van elektrische lading, is de regel omgekeerd. Soortgenoten kunnen elkaar afstoten, terwijl tegengestelden elkaar aantrekken. Stationaire fasen voor ionenuitwisselingsscheidingen worden gekenmerkt door de aard en de sterkte van de zure of basische functies op hun oppervlak en de soorten ionen die zij aantrekken en vasthouden. Kationenwisseling wordt gebruikt om positief geladen ionen op een negatief oppervlak vast te houden en te scheiden. Omgekeerd wordt anionenwisseling gebruikt om negatief geladen ionen op een positief oppervlak vast te houden en af te scheiden. Bij elk type ionenwisseling zijn er ten minste twee algemene benaderingen voor scheiding en elutie.
Figuur T: Ion-Exchange Chromatography
Sterk ionenwisselaars hebben functionele groepen die altijd geïoniseerd zijn. Zij worden doorgaans gebruikt om zwakke ionen vast te houden en te scheiden. Deze zwakke ionen kunnen worden geëlueerd door ze te verplaatsen met een mobiele fase die ionen bevat die sterker door de stationaire fase worden aangetrokken. Als alternatief kunnen zwakke ionen op de kolom worden vastgehouden en vervolgens worden geneutraliseerd door ter plaatse de pH van de mobiele fase te wijzigen, waardoor zij hun aantrekkingskracht verliezen en elueren.
Zwakke ionenwisselaars kunnen boven of onder een bepaalde pH-waarde worden geneutraliseerd en verliezen hun vermogen om ionen vast te houden door lading. Wanneer zij geladen zijn, worden zij gebruikt om sterke ionen vast te houden en te scheiden. Als deze ionen niet door verplaatsing kunnen worden geëlueerd, kunnen de uitwisselingsplaatsen van de stationaire fase worden geneutraliseerd, waardoor de ionische aantrekkingskracht wordt uitgeschakeld en de geladen analyten kunnen worden geëlueerd.
Tabel D: Ionenwisselingsrichtsnoeren
Wanneer zwakke ionenwisselaars zijn geneutraliseerd, kunnen zij soorten vasthouden en scheiden door hydrofobe of hydrofiele interacties; in deze gevallen wordt de elutiesterkte bepaald door de polariteit van de mobiele fase. Zo kunnen zwakke ionenwisselaars worden gebruikt voor scheidingen in gemengde modi.
Tabel D geeft een overzicht van de richtlijnen voor de voornaamste categorieën van ionenwisseling. Om bijvoorbeeld een sterk basische analyt vast te houden, moet een zwak kationenuitwisselende stationaire fase worden gebruikt bij pH > 7; hierdoor wordt een negatief geladen deeltjesoppervlak gewaarborgd. Om de sterke base vrij te maken of te elueren, verlaagt u de pH van de mobiele fase onder 3; dit verwijdert de oppervlaktelading en schakelt het ionenuitwisselingsretentiemechanisme uit.
Merk op dat een pKa de pH-waarde is waarbij 50% van de functionele groep geïoniseerd is en 50% neutraal is. Om te zorgen voor een in wezen neutrale, of een volledig geladen analyt of deeltjesoppervlak, moet de pH worden bijgesteld tot een waarde die ten minste 2 eenheden boven de pKa ligt.
Gebruik geen sterke-kationenwisselaar om een sterke base te behouden; beide blijven geladen en sterk tot elkaar aangetrokken, waardoor de base bijna onmogelijk kan worden geëlueerd. De base kan alleen worden verwijderd door de sterke kationenwisselaar te overspoelen met een concurrerende base die een nog sterkere retentie heeft en de verbinding van belang verdringt door de concurrentie om de actieve uitwisselingsplaatsen te winnen. Deze aanpak is zelden praktisch, of veilig, in HPLC en SPE.
Separaties op basis van grootte: Size-Exclusion Chromatography –
In de jaren 1950 ontdekten Porath en Flodin dat biomoleculen konden worden gescheiden op basis van hun grootte, in plaats van op basis van hun lading of polariteit, door ze door een hydrofiel dextraanpolymeer met gecontroleerde porositeit te laten gaan, of ze te filtreren. Dit proces werd gelfiltratie genoemd. Later werd een analoog schema gebruikt om synthetische oligomeren en polymeren te scheiden met behulp van organisch-polymeerpakkingen met specifieke poriegrootte. Dit proces werd gel-permeatiechromatografie genoemd. Soortgelijke scheidingen, waarbij gebruik werd gemaakt van silicaverpakkingen met gecontroleerde poriën, werden size-exclusion chromatografie genoemd. De eerste commerciële HPLC-instrumenten, die in 1963 werden geïntroduceerd, waren ontworpen voor GPC-toepassingen.
Al deze technieken worden gewoonlijk uitgevoerd op stationaire fasen die zijn gesynthetiseerd met een poriegrootteverdeling binnen een bereik dat het mogelijk maakt dat de te onderzoeken analyten meer of minder van het porievolume van de pakking binnendringen of daarvan worden uitgesloten. Kleinere moleculen penetreren meer poriën bij hun passage door het bed. Grotere moleculen kunnen slechts poriën boven een bepaalde grootte binnendringen, zodat zij minder tijd in het bed doorbrengen. De grootste moleculen kunnen volledig van de poriën worden uitgesloten en alleen tussen de deeltjes passeren, zodat ze zeer snel in een klein volume worden geëlueerd. Mobiele fasen worden om twee redenen gekozen: ten eerste zijn zij goede oplosmiddelen voor de analyten en ten tweede kunnen zij eventuele interacties tussen de analyten en het oppervlak van de stationaire fase voorkomen. Op deze manier elueren de grotere moleculen eerst, terwijl de kleinere moleculen langzamer gaan en later elueren, in afnemende volgorde van hun grootte in oplossing. Vandaar de eenvoudige regel: De groten komen eerst.
Sinds het mogelijk is het molecuulgewicht van een polymeer met zijn grootte in oplossing te correleren, revolutioneerde GPC het meten van de molecuulgewichtsverdeling van polymeren die, op zijn beurt, de fysische kenmerken bepaalt die polymeer verwerking, kwaliteit, en prestaties kunnen verbeteren, of afbreken.