Sperimentazione clinica di fase 1 di Trametes versicolor in donne con cancro al seno

Abstract

Introduzione. Si è ipotizzato che i preparati del fungo Trametes versicolor (Tv) somministrati per via orale possano migliorare la risposta immunitaria nelle donne con cancro al seno dopo la chemioterapia e la radioterapia standard. Metodi. Uno studio di fase I, in due centri, è stato fatto per determinare la dose massima tollerata di una preparazione Tv quando viene assunta quotidianamente in dosi divise per 6 settimane dopo il recente completamento della radioterapia. Sono state reclutate undici partecipanti e nove donne hanno completato lo studio. Ogni coorte era composta da tre partecipanti a cui è stata data una delle tre dosi di Tv (3, 6 o 9 grammi). I dati immunitari sono stati raccolti prima e dopo la radioterapia, in 3 momenti del trattamento e dopo un washout di 3 settimane. Risultati. Sono stati riportati nove eventi avversi (7 lievi, 1 moderato e 1 grave), suggerendo che Tv è stato ben tollerato. I risultati immunologici hanno indicato tendenze in (1) aumento della conta dei linfociti a 6 e 9 grammi/giorno; (2) aumento dell’attività funzionale delle cellule natural killer a 6 grammi/giorno; (3) aumenti correlati alla dose delle cellule T CD8+ e delle cellule B CD19+, ma non delle cellule T CD4+ o delle cellule NK CD16+56+. Conclusioni. Questi risultati dimostrano che fino a 9 grammi al giorno di una preparazione di Tv è sicura e tollerabile in donne con cancro al seno nel contesto del trattamento postprimario. Questa preparazione di Tv può migliorare lo stato immunitario in pazienti immunocompromesse con cancro al seno dopo un trattamento oncologico primario standard.

1. Introduzione

Trametes versicolor (Tv), noto anche come Coriolus versicolor e comunemente chiamato Turkey Tail, è una specie di fungo da cui sono state fatte preparazioni che hanno una lunga storia di utilizzo nella medicina tradizionale asiatica. Due frazioni di proteoglicani, polisaccaride-K (PSK) e polisaccaride-peptide (PSP), sono estratti di acqua calda simili di Tv con attività anticancro riportata. In Giappone, PSK è prescritto ai pazienti oncologici di routine, sia durante che dopo le radiazioni e la chemioterapia. È anche una pratica comune tra molti medici naturopatici (ND) e oncologi integrativi (MD) negli Stati Uniti per prescrivere intero, liofilizzato Tv a pazienti con cancro al seno. Si ipotizza che l’attività immunologica di Tv sia il principale meccanismo di base responsabile dei suoi effetti antitumorali e del suo impatto sui tassi di sopravvivenza. Il meccanismo d’azione di Trametes versicolor coinvolge il potenziamento delle risposte immunitarie innate e adattative, almeno in parte attraverso l’attività agonista del recettore Toll-like 2. Gli studi preclinici sugli animali e i dati clinici preliminari supportano l’ipotesi che i derivati di Tv possano essere utili nel trattamento dei tumori negativi e positivi al recettore degli estrogeni, mitigando gli effetti immunologici depressivi del trattamento e migliorando la sopravvivenza libera da malattia attraverso il miglioramento della sorveglianza immunologica e il superamento della tolleranza all’antigene del tumore.

La comprensione di come i fattori immunologici sono influenzati dai trattamenti nel cancro al seno suggerisce aree promettenti di attenzione nello sviluppo di terapie aggiuntive per rafforzare le risposte immunitarie antitumorali. Dati recenti dimostrano che alcune classi di farmaci chemioterapici causano la morte immunogenica delle cellule tumorali, che porta al miglioramento della rappresentazione incrociata dell’antigene e alla stimolazione della risposta immunitaria antitumorale. L’evidenza suggerisce che le cellule NK giocano un ruolo importante nella prevenzione del cancro al seno sia iniziale che metastatico. Alcuni pazienti con cancro al seno sono stati segnalati come privi di attività delle cellule NK contro le cellule bersaglio K562. I dati attuali suggeriscono che i pazienti con cancro al seno che hanno completato la chirurgia, la chemioterapia e la radioterapia hanno un deficit immunologico. Andersen et al. hanno riferito che i livelli di stress nelle pazienti con cancro al seno predicevano significativamente una minore lisi delle cellule NK e una minore risposta proliferativa ai linfociti del sangue periferico. Il nostro precedente studio di osservazione ha confermato che la linfopenia e la bassa attività delle cellule NK erano presenti durante le 6 settimane dopo il completamento della radioterapia.

Per comprendere meglio il potenziale beneficio di Trametes versicolor nelle donne con cancro al seno, era necessario uno studio di escalation della dose per valutare la sicurezza e la tollerabilità. A tal fine, un team multidisciplinare dell’Università del Minnesota e della Bastyr University ha completato uno studio di fase 1 per determinare la sicurezza e la dose massima tollerata di Tv in donne con diagnosi di cancro al seno, sottoposte a trattamento standard per il cancro al seno e disposte a partecipare a uno studio di nove settimane dopo la radioterapia.

2. Metodi

2.1. Escalation della dose dello studio

Si è utilizzato un disegno standard di fase 1 con 3 soggetti per livello di dose fino al raggiungimento della MTD (dose massima tollerata). Lo schema di escalation della dose per ogni coorte di Tv era di 3 gm (la dose più comunemente usata); 6 gm; 9 gm; 12 gm; 18 gm; 24 gm. Questo studio ha reclutato solo attraverso la coorte di nove grammi (𝑁=9).

2.2. Partecipanti allo studio

Donne di età compresa tra i 21 e i 75 anni, con diagnosi di cancro al seno di stadio I, II o III, sottoposte a chirurgia e chemioterapia e pronte a iniziare la radioterapia, sono state arruolate nello studio dopo aver fornito il consenso scritto. L’idoneità comprendeva anche la disponibilità a seguire una dieta coerente per tutto lo studio e ad evitare fonti alimentari di funghi e altri prodotti erboristici con effetti immunomodulanti durante la radioterapia e fino al completamento dello studio. Le funzioni ematologiche, renali ed epatiche di base entro i limiti normali sono state richieste prima dell’arruolamento nello studio. Lo studio è stato condotto presso il Cancer Center dell’Università del Minnesota a Minneapolis, Minnesota e la Bastyr University a Ken more, Washington. Lo studio è stato approvato dai comitati IRB dell’Università del Minnesota e della Bastyr University. Tra gennaio 2008 e giugno 2010 undici donne con cancro al seno in stadio I-III hanno soddisfatto i criteri ristretti per questo studio, hanno acconsentito a partecipare e sono state arruolate in sequenza dalla coorte con il dosaggio più basso. Tre partecipanti in ciascuna delle coorti 3 gm, 6 gm e 9 gm hanno completato lo studio. Due delle partecipanti si sono ritirate dallo studio dopo la seconda visita a causa di difficoltà nel trasporto alla clinica. Le caratteristiche delle nove donne che hanno completato lo studio includevano un’età compresa tra i 38 e i 68 anni; sei ER negative e tre ER positive; tre tumori al seno in stadio I, due in stadio II e quattro in stadio III. Una delle donne che ha completato lo studio non si è sottoposta a chemioterapia prima della radiazione, e una violazione del protocollo di ammissibilità è stata segnalata all’IRB.

2.3. Misure di risultato

L’obiettivo primario dello studio è stato quello di valutare la sicurezza e la tollerabilità di Trametes versicolor in donne con cancro al seno nell’impostazione postradioterapia. Le nove partecipanti allo studio di escalation della dose sono state monitorate per gli eventi avversi (AEs) utilizzando sia metodi clinici che di laboratorio e criteri di tossicità limitanti la dose (DLT) definiti come qualsiasi tossicità di grado 2 o superiore correlata al trattamento, come segnato utilizzando i criteri di terminologia comune per gli eventi avversi V 3.0 (CTCAE) dell’NCI. Le donne sono state sottoposte a screening settimanale per gli eventi avversi durante la somministrazione del prodotto durante la loro visita clinica o tramite screening telefonico tra le visite. L’obiettivo secondario era quello di raccogliere dati preliminari che confrontassero i valori di riferimento pre e post-terapia, le misure immunologiche al trattamento e post-trattamento, tra cui l’emocromo completo con differenziale, l’attività delle cellule natural killer (NK), il test delle cellule T regolatrici, il test del sottogruppo di cellule T/B/NK, l’indice fagocitico e i livelli di citochine. Le analisi statistiche, compresi i test t a campione indipendente e le ANOVA a una via con confronto multiplo post hoc della Turchia, sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism, versione 5.04 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Al fine di aumentare la potenza e la dimensione del campione, i dati di uno studio osservazionale (𝑁=14) condotto dai nostri centri dal 2006 sono stati combinati con l’attuale studio di escalation della dose (𝑁=9). I criteri di ammissibilità erano identici per entrambi gli studi (𝑁=23).

2.4. Prodotto farmaceutico a base di funghi

La polvere miceliale liofilizzata di Frametes versicolor è stata ottenuta da Paul Stamets di Fungi Perfecti, Inc., Olympia, WA ed è stata incapsulata da Beehive Botanicals (Hayward, WI). Ogni capsula conteneva 500 mg di prodotto. L’approvazione FDA IND (# 75,405) è stata ottenuta nel 2007.

2.5. Crisi immunitarie

2.5.1. Emocromo completo con differenziale

Le analisi cliniche di laboratorio (emocromo, chimica, test di gravidanza del siero e analisi delle urine) sono state eseguite presso il Dipartimento di Medicina di Laboratorio dell’Università di Washington per i partecipanti reclutati nel sito della Bastyr University e presso il Laboratorio Diagnostico Fairview dell’Università del Minnesota per i partecipanti reclutati nel sito dell’U del Minnesota.

2.5.2. Attività funzionale delle cellule Natural Killer

Il sottoinsieme delle cellule immunitarie misurato includeva l’attività delle cellule NK, il test delle cellule T regolatrici, il test del sottoinsieme delle cellule T/B/NK, l’indice fagocitico e i livelli delle citochine. I test immunologici sono stati condotti presso il laboratorio della Bastyr University per i soggetti reclutati da entrambi i siti. Il sangue raccolto all’Università del Minnesota General Clinical Research Center (GCRC) è stato spedito durante la notte alla Bastyr University. La qualità del sangue trasportato dall’Università del Minnesota alla Bastyr è stata valutata in base ai seguenti criteri. Per i campioni più vecchi di 48 ore quando sono arrivati al laboratorio Bastyr, i linfociti sono stati isolati e la vitalità delle cellule è stata determinata dalla colorazione blu trypan. Se la vitalità era superiore all’80%, il test è stato eseguito. Se la vitalità era inferiore all’80%, i campioni sono stati scartati. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate mediante gradiente Ficoll-Hypaque (densità = 1,070 g/mL), lavate due volte in PBS, e mantenute in RPMI 1640, 10% FBS con 2 mM L-Gln e penicillina-streptomicina (1000 U/mL; 1 mg/mL). L’attività delle cellule NK di questi campioni PBMC, misurata in base alla capacità di uccidere le cellule bersaglio del tumore K562, è stata valutata in triplicato ai rapporti tra effettore e bersaglio (E : T) di 50 : 1, 25 : 1, e 12.5 : 1 seguendo i metodi pubblicati. Le cellule bersaglio sono state etichettate con 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiOC18) e co-coltivate con cellule effettrici PBMC per quattro ore. Un campione di controllo con sole cellule K562 è stato incluso per determinare la morte spontanea delle cellule bersaglio. Dopo l’incubazione, è stato aggiunto ioduro di propidio per rilevare le cellule morte. La percentuale di cellule bersaglio uccise è stata determinata sottraendo la percentuale di lisie spontanee dalla percentuale di lisi specifica (PSL) del rispettivo rapporto E : T. Per rappresentare l’attività standardizzata delle cellule NK, le unità litiche sono state calcolate da un programma software precedentemente pubblicato e convalidato utilizzando i seguenti parametri: target per pozzetto = 10.000; LU per n. di cellule = 107; curva massima = 48; percentuale di lisie = 20 . I valori di LU20, definiti come il rapporto E : T rapporto in cui il 20% della morte delle cellule bersaglio si verifica, sono stati estrapolati da curve dose-risposta di PSL contro log E : T per ogni campione di sangue analizzato.

2.5.3. Le sospensioni di PBMC (5×105 cellule) sono state messe in 3 provette, lavate in PBS, centrifugate, i surnatanti come pirata e il pellet di cellule risospese in 100 μL di PBS. Le PBMC nella provetta 1 sono state colorate con CD3-PC5, CD4-PE, e CD8-FITC; provetta 2: CD3-PC5, CD16-FITC, e CD56-PE; provetta 3: CD14-PC5. Le provette sono state agitate brevemente, coperte e incubate in ghiaccio per 15 minuti, dopodiché le cellule sono state lavate in PBS freddo due volte, risospese a 0,5 mL in PBS e la percentuale di sottoinsiemi di PBMC determinata mediante analisi citometrica a flusso utilizzando un Beckman Coulter FC500 e il software CXP.

2.6. Protocollo dello studio clinico

La durata dello studio è stata di nove settimane ed è iniziata dopo il completamento della radioterapia. Comprendeva sei settimane di utilizzo del prodotto seguite da un periodo di tre settimane di non utilizzo del prodotto (Figura 1). I pazienti sono stati selezionati e determinati idonei per lo studio dopo il completamento della chemioterapia e prima dell’inizio della radioterapia. Lo studio ha richiesto sei visite ai centri di ricerca clinica. La prima visita dello studio si è svolta prima dell’inizio della radioterapia, durante la quale sono stati prelevati gli esami di laboratorio di base. Entro la prima settimana dal completamento della radioterapia, i partecipanti hanno avuto la loro seconda visita durante la quale sono stati prelevati i laboratori e lo studio di nove settimane è iniziato. Sono state fornite sei settimane di prodotto Tv al partecipante, che è tornato al centro di ricerca per le visite tre, quattro e cinque, a due settimane di distanza l’una dall’altra, per il prelievo delle analisi e la valutazione della tollerabilità del prodotto e degli eventi avversi. La visita finale (sesta) è stata a nove settimane, dopo tre settimane senza prodotto, per un ultimo prelievo di laboratorio e la valutazione di eventuali eventi avversi prolungati.

Il protocollo di escalation della dose ha coinvolto coorti di un minimo di tre partecipanti che hanno ingerito Tv per via orale in dosi divise ogni giorno per sei settimane. La prima coorte ha assunto 3 grammi al giorno in due dosi divise; la seconda coorte ha assunto 6 grammi al giorno in due dosi divise; la terza coorte ha assunto 9 grammi al giorno in tre dosi divise. Tre grammi al giorno è la dose più comunemente usata nella pratica medica naturopatica e fino a 9 grammi è usata in Giappone. L’obiettivo dello studio era di determinare la dose massima tollerata (MTD) che dimostrasse sicurezza e tollerabilità (Tabella 1).

3. Risultati

3.1. Eventi avversi

I risultati di questo studio di escalation della dose hanno mostrato che fino a 9 grammi/giorno di preparazione Tv è stata ben tollerata in donne con cancro al seno per sei settimane nell’impostazione del trattamento post-radiazione. Ci sono stati nove eventi avversi; sette lievi, uno moderato, e solo un evento avverso di grado 3 che era un attacco d’ansia in un partecipante che era probabilmente non collegato al farmaco dello studio (Tabella 2). Altri eventi avversi lievi segnalati hanno incluso bruciore cardiaco transitorio, palpitazione cardiaca, costipazione, dolore al petto, febbre, dermatite da radiazioni e sintomi da raffreddamento/influenza. Tutte e tre le dosi sono state ben tollerate, e i partecipanti non hanno avuto difficoltà a deglutire fino a 9 capsule tre volte al giorno. Da notare che non sono stati riportati né nausea né disturbi gastrointestinali; due effetti collaterali sono stati riportati in precedenti studi clinici di altri estratti di Tv.

3.2. Risposta immunitaria

Il comparto dei globuli rossi non è stato influenzato sia dalla radioterapia (RT) che dalla somministrazione di Tv. Il conteggio assoluto dei globuli rossi, l’emoglobina e l’ematocrito erano normali alla prima visita, il giorno prima dell’inizio della radioterapia, e hanno continuato a rientrare nei limiti normali per tutto il resto dello studio. Il conteggio assoluto dei globuli bianchi e dei neutrofili era generalmente entro i limiti normali per tutte le donne sia prima che dopo la RT e durante le settimane dopo la RT mentre prendevano la Tv (dati non mostrati). Tuttavia, la conta assoluta dei linfociti ha rivelato un modello diverso dagli altri sottoinsiemi CBC. Poiché i criteri di eleggibilità erano identici negli studi condotti dai nostri centri dal 2006, per aumentare la potenza, abbiamo combinato i dati del nostro studio osservazionale (𝑁=14) che ha dimostrato che la RT produceva difetti immunitari nelle donne con cancro al seno in stadio I-III con il nostro attuale studio di escalation della dose (𝑁=9). Per il numero combinato di 23 donne in entrambi gli studi con stato di cancro al seno in stadio I-III dopo l’intervento chirurgico al seno e la chemioterapia che hanno poi ricevuto la radioterapia, i linfociti erano entro i limiti normali prima della RT ma sono scesi a livelli anormalmente bassi dopo la RT. Il conteggio medio dei linfociti per tutti i 23 soggetti prima della RT era di 1,027±0,298 ed è sceso del 20% dopo la RT a 0,681±0,254, una differenza che era statisticamente significativa. Nello studio di escalation della dose, le due dosi orali più alte (6 e 9 g) di Tv hanno portato a un recupero anticipato della conta dei linfociti (Figura 2). Il numero di linfociti ha recuperato gradualmente per il gruppo di osservazione, ma la conta media dei linfociti è rimasta inferiore a quella delle coorti 6 e 9 g di Tv a 6 settimane dopo la RT. A causa del numero ridotto per ogni coorte di dosi (𝑁=3), la significatività statistica è stata trovata solo tra il gruppo osservazionale e quello da 9 g al punto temporale di 2 settimane dopo la radioterapia. La radioterapia ha depresso in modo statisticamente significativo il numero assoluto di linfociti nelle donne con cancro al seno in stadio I-III che hanno completato la chirurgia e la chemioterapia (vedi Figura 2).

L’attività funzionale delle cellule killer naturali era drammaticamente ridotta dal pre al post-RT per tutte le 23 pazienti con cancro al seno che hanno completato le prime due visite dello studio osservazionale (𝑁=14) o dello studio di escalation della dose (𝑁=9). La figura 3 mostra che l’attività media delle cellule NK era 19,941±18,959 prima della RT e diminuì a 9,872±13,454 dopo la RT (𝑁=23). Questo declino era statisticamente significativo (𝑡(44)=2,077, 𝑃=0,043). Una tendenza verso l’aumento dell’attività delle cellule NK è stata osservata nella coorte della dose di 6 g Tv.

Per quanto riguarda la conta delle cellule NK CD16+56+, non sono stati osservati cambiamenti significativi dovuti né alla radioterapia né alla somministrazione di Tv (Figura 6). Poiché l’attività delle cellule NK è stata sia diminuita dalla radioterapia che aumentata nella coorte con dose di 6 grammi di Tv (Figura 3), ma le popolazioni di cellule NK non sembravano essere significativamente influenzate da questi trattamenti, i dati suggeriscono che il miglioramento dell’attività delle cellule NK non è dovuto ad alterazioni indotte dal trattamento nel numero di cellule NK. La popolazione delle cellule NK non è stata influenzata né dalla radioterapia né da dosi orali di Tv (vedi Figura 6).

4. Discussione

I risultati di questo studio stabiliscono la sicurezza della somministrazione orale di una preparazione di Trametes versicolor (Tv) a dosi di 3, 6 e 9 grammi, senza gravi eventi avversi di questa terapia in donne dopo la radioterapia per il trattamento del cancro al seno. Lo studio attuale conferma la nostra precedente relazione che la radioterapia standard del torace per il cancro al seno non influisce sul compartimento dei globuli rossi o dei neutrofili, ma induce carenze immunitarie specifiche tra cui linfopenia e depressione dell’attività funzionale delle cellule NK. Le terapie con cellule NK stanno emergendo in tutto il mondo come promettenti trattamenti antitumorali, sfruttando la rapida azione citolitica degli effettori NK e la loro potenziale ampia applicabilità contro una vasta gamma di tumori maligni. La nostra nuova scoperta è che la perdita di attività delle cellule NK sembra essere indipendente dal numero di cellule NK. Qui dimostriamo che la RT riduce l’attività delle cellule NK per ogni cellula NK. Dosi orali più elevate di Tv a 6 e 9 grammi al giorno sono state associate a un recupero più rapido dei linfociti e dell’attività delle cellule NK, così come a un aumento del numero di cellule CD8+T e di cellule B CD19+. Non c’è stato alcun effetto evidente di Tv sul numero di cellule NK CD 16+/56+, solo sulla loro attività funzionale. Mentre c’è una tendenza verso dosi più alte di Tv che hanno un’attività immunologica più pronunciata, questo studio di fase I di escalation della dose non è stato progettato per valutare i cambiamenti dose-dipendenti nei marcatori immunitari. I dati preliminari con questi piccoli campioni di 3 pazienti con cancro al seno per gruppo di coorte di dose che mostrano tendenze legate alla dose portano all’ipotesi verificabile che 6 grammi di Tv possono portare a un recupero immunitario più veloce dopo la radioterapia. I risultati di questo studio di fase I giustificano e costituiscono la piattaforma su cui possono procedere gli studi randomizzati controllati di fase II sulla dose-risposta.

Anche se questo studio ha mostrato la sicurezza di Trametes versicolor a una dose giornaliera di 9 grammi, lo studio di escalation della dose è stato progettato per valutare la dose massima tollerata (MDT); quindi questo studio non ha determinato la sicurezza e la tollerabilità alla dose più alta. Il reclutamento di donne in una coorte di 12 grammi e oltre non è stato raggiunto a causa di molteplici fattori limitanti. In primo luogo, le donne dovevano soddisfare criteri di ammissibilità molto rigorosi per iscriversi allo studio ed essere sottoposte a chirurgia, chemioterapia e radiazioni nel loro protocollo di trattamento. Attualmente, molte donne con una diagnosi di cancro al seno non ricevono un regime di tripla terapia. A molte donne viene diagnosticato un cancro al seno allo stadio 1 e vengono sottoposte a nodulectomia e radiazioni, e se il loro punteggio oncotype è basso, non ricevono la chemioterapia. Inoltre, molte donne sono state reclutate in altri studi di ricerca e sono state saturate da richieste di arruolamento in ulteriori studi. Soprattutto, abbiamo scoperto che le donne dopo aver completato un lungo regime di trattamento di chemioterapia e radiazioni erano riluttanti a partecipare a uno studio di nove settimane che richiedeva sei visite aggiuntive all’Università.

I dati di fase I suggeriscono che Tv è un’immunoterapia sicura per le pazienti con cancro al seno che può correggere i difetti immunitari legati alla radioterapia. Sulla base dei nostri risultati, la terapia a base di funghi Tv somministrata per via orale nel contesto postradioterapia può aumentare il numero di linfociti e l’attività tumoricida delle cellule NK. La ricaduta dopo il trattamento primario del cancro al seno può essere legata a difetti del sistema immunitario innato e adattativo. La ricerca del nostro centro continua ad indicare che Trametes versicolor rappresenta una nuova terapia immunitaria con applicazioni significative nel trattamento del cancro.

Approvazione etica

Tutti gli esperimenti eseguiti sono conformi alle leggi vigenti negli USA.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institutes of Health/National Center for Complementary and Alternative Medicine (U19 AT 1998) e dal Gateway for Cancer Research Grant no. G-04-002. Gli autori ringraziano anche il supporto editoriale di Rebekah Pratt del dipartimento di medicina familiare dell’U of MN e Daniel Strenge per il suo contributo.