Sintesi del DNA da substrati difosfati da parte delle DNA polimerasi

Risultati e discussione

Abbiamo iniziato testando Taq (da Thermus aquaticus), Vent ad alta fedeltà (exo-, da Thermococcus litoralis), Pfu (exo+, da Pyrococcus furiosus), Deep Vent (exo+, da Pyrococcus sp. GB-D), e Q5 (exo+) DNA polimerasi nelle tradizionali reazioni a catena della polimerasi (PCR) con un deossiribonucleoside monofosfato (dGMP), dNDPs, e dNTPs come substrati (Fig. 1 A e B). La sostituzione di uno qualsiasi dei dNTPs per dNDPs ha sostenuto la sintesi del DNA robusto, e ulteriori esperimenti con due, tre, o tutti e quattro i dNDPs invece di dNTPs sostenuto PCR. Per garantire che i prodotti non derivassero da dNTPs contaminanti e che le reazioni non fossero potenziate da stabilizzatori presenti in buffer commerciali o stock di enzimi, abbiamo testato la sintesi del DNA da dNDPs purificati usando buffer ed enzimi fatti in casa. Abbiamo anche incluso enzimi replicativi batterici, come le DNA polimerasi replicative batteriche del Bacillus stearothermophilus termofilo (Bst) e del Bacillus subtilis mesofilo (Bsu, frammento grande). Queste, insieme alle polimerasi arcaiche di Thermococcus kodakensis (KOD), Thermococcus sp. 9°N (9°N) e Thermococcus gorganarius (Tgo), hanno mostrato robuste estensioni di primer usando solo 100 µM di dNDP purificato a 60 °C (tranne Bsu, che è stato testato a 37 °C in tutti i casi) (Fig. 1C). Le reazioni di estensione del primer sono state efficienti per tutti questi enzimi, in particolare per Deep Vent, KOD e 9°N. La pausa è stata osservata prima dell’incorporazione di dA e dC nell’oligonucleotide nascente (Fig. 1 C e D), suggerendo che i KM per il dADP e dCDP sono abbastanza alti da rallentare l’estensione del primer ad una concentrazione di substrato di 100-µM.

Per ottenere una visione meccanicistica della reazione, abbiamo prima studiato la sua efficienza utilizzando l’enzima Taq. Variando la temperatura di estensione da 50 °C a 72 °C non si è avuta alcuna differenza osservabile nella quantità di prodotto completo. Per semplificare le analisi cinetiche, tutte le reazioni di PCR sono state eseguite utilizzando un protocollo di ciclaggio a due fasi, in cui il primer è stato ricotto ed esteso nella prima fase a 72 °C e il duplex fuso a 95 °C nella seconda fase (Fig. S1A). Per confrontare i tassi di utilizzo dNDP ai dNTP canonici, il tempo di estensione è stato variato da 15 a 120 s. Per un tempo di estensione 15-s, la reazione dNTP prodotto circa quattro volte il prodotto rispetto alla reazione di estensione 2 minuti che conteneva il dNDPs (Fig. S1B). Questi dati hanno suggerito che il tasso di incorporazione per i difosfati è più lento di quello dei trifosfati tradizionali, come ci si aspetterebbe considerando la più bassa energia di stato terra dei dNDPs. Abbiamo poi chiesto se un singolo o tutti e quattro i dNDP sono responsabili del tasso di incorporazione più lento. La PCR quantitativa (qPCR) è stata usata per una misurazione accurata della formazione del prodotto. Ogni difosfato è stato interrogato indipendentemente combinandolo con 0,2 mM degli altri tre dNTP per amplificare un modello di DNA lungo. Queste reazioni sono state normalizzate ad una reazione di controllo, che conteneva 0,2 mM di tutti e quattro dNTPs (Fig. S1C). Un valore di 1 indica che un difosfato è incorporato con la stessa efficienza del suo analogo trifosfato. Questi risultati suggeriscono che il dADP è incorporato in modo meno efficiente (1 mM dADP ha prodotto ∼60% di 0,2 mM dATP), seguito da desossitimidina difosfato (dTDP) e desossicitidina difosfato (dCDP). D’altra parte, solo un aumento di due volte della concentrazione di dGDP è necessario per raggiungere la stessa efficienza di PCR della reazione di controllo dGTP.

Per analizzare direttamente la polimerizzazione del DNA, abbiamo eseguito una reazione di estensione di un primer marcato con 32P e un template lungo (706 nt). La concentrazione di difosfato è stata variata da 0,1 a 1,0 mM e combinata con 0,2 mM degli altri tre dNTP, simile alle reazioni qPCR descritte sopra. Come previsto, l’aumento delle concentrazioni di dADP ha diminuito la quantità di tempo necessario per produrre il prodotto completo (Fig. 1E). Pausa lungo la lunghezza del DNA modello è stato osservato solo nel caso di dADP, suggerendo che la polimerasi si blocca durante l’incorporazione di substrati dADP (Fig. 1E). D’altra parte, la mancanza di pausa nella reazione dTDP suggerito che dTDP è stato utilizzato in modo più efficiente di dADP (Fig. S2A), come suggerito dall’analisi qPCR (Fig. S1A). L’analisi della formazione del prodotto ha suggerito che la concentrazione di dADP richiesta per raggiungere il tasso di semi-massimo è ∼420 µM (Fig. S2B), più di un ordine di grandezza sopra il KM per i dNTPs misurati in precedenza (16 e 24 µM) (5, 6). Vicino alla concentrazione saturante di dADP, il DNA completo viene sintetizzato in circa 30 s e, dato che la sequenza 706-nt contiene 182 adenosine, la velocità media di utilizzo del dADP è almeno ∼6 s-1. Questo è circa un ordine di grandezza più lento della velocità media di utilizzo dei dNTP da parte della Taq polimerasi (kcat = 47 s-1) ed è entro 1,5 volte il kcat di Pfu (7).

Per confrontare ulteriormente la cinetica della sintesi del DNA su template lunghi da dNDPs e dNTPs, abbiamo usato un template del plasmide M13mp18 a singolo filamento (ssDNA) di 7.249 nt (8). Le polimerasi Bsu (a 37 °C), Bst e Taq (a 60 °C) hanno mostrato una robusta sintesi di DNA da dNDPs (Fig. S2C). Abbiamo misurato il tasso di sintesi del DNA utilizzando la fluorescenza dell’intercalare SYTO9, osservato da un termociclatore in tempo reale al variare delle concentrazioni di dNDP e dNTP (Fig. S2D) (9). Un grafico di questi tassi rispetto alla concentrazione del nucleotide ha rivelato un KM apparente di ∼0,4 mM per i dNDP e un tasso massimo di sintesi che è circa 17 volte inferiore per i dNDP rispetto ai dNTP (Fig. S2E). Questi risultati mostrano, in un confronto diretto in condizioni identiche, che il tasso di sintesi del DNA dai dNDPs è poco più di un ordine di grandezza inferiore a quello dei dNTPs e che Vmax/KM è quindi circa 400 volte inferiore per i dNDPs rispetto ai dNTPs.

La reazione di polimerizzazione con substrati trifosfati canonici aumenta la lunghezza del filamento di DNA nascente di un nucleotide, rilasciando un PPi (3). Durante la reazione inversa, la pirofosforolisi, il primer viene accorciato di un nucleotide e viene rilasciato un dNTP. Analogamente, quando i dNDP sono usati come substrati, le polimerasi rilasciano fosfati, e la reazione inversa è la fosforolisi del DNA (Fig. 2A). Per confermare che le polimerasi utilizzano direttamente i dNDP e non usano un’attività enzimatica finora sconosciuta (o una nucleotide difosfato chinasi copurificata) che converte due dNDP in un dNTP e un dNMP, abbiamo usato dNDP purificati e analizzato i prodotti di una reazione di estensione del primer. Abbiamo misurato la produzione di fosfato usando un sensore fluorescente, che è derivato dalla proteina batterica legante il fosfato ed esibisce un’alta specificità per il fosfato (10). Abbiamo trovato che, in presenza di dNDP purificati e Taq DNA polimerasi, il fosfato si accumula (Fig. 2B), ma in esperimenti senza la polimerasi, non lo fa. Negli esperimenti di controllo con dNTPs, la produzione di fosfato è stata osservata, ma il suo tasso era più lento e indipendente dall’enzima, suggerendo che il fosfato rilevato derivava dalla degradazione dNTP a dNDP e fosfato e non era legato alla sintesi del DNA. Questi risultati hanno confermato che la Taq utilizza direttamente i dNDP come substrati, rilasciando il fosfato come sottoprodotto della sintesi del DNA. Quando abbiamo misurato la quantità di fosfato prodotto nelle estensioni del primer sul 7.249-nt M13 ssDNA descritto sopra, abbiamo trovato che ∼1-11 µM di fosfato è stato prodotto utilizzando un template di 1,6-nM oltre la produzione di fosfato di fondo dalla degradazione del dNDP (Fig. S3A). Questa concentrazione di fosfato corrisponde a ∼2-6.000 molecole per DNA, o circa 0,1-0,9 del template copiato usando i dNDP. L’ampio intervallo deriva da un fondo di fosfato relativamente grande nel materiale di partenza e dalla reazione di fondo sottratta dal segnale nella reazione di estensione del primer.

Per verificare che le reazioni non producano dNTPs da dNDPs, abbiamo incubato la Taq polimerasi con 250 µM di dCDP e dTDP e risolto le reazioni mediante cromatografia a scambio ionico (Fig. S3B). Questa analisi non ha rivelato alcuna nuova specie molecolare corrispondente a nucleotidi mono- o trifosforilati nella reazione contenente l’enzima, rispetto alla reazione senza enzima, indicando una mancanza di attività di fosforil transferasi nella preparazione dell’enzima e sostenendo ulteriormente l’utilizzo diretto dei dNDP nella sintesi del DNA.

Come descritto sopra, le reazioni con substrati dNDP rilasciano un fosfato inorganico (Pi), e la reazione inversa è quindi la fosforolisi del DNA (Fig. 2A). Per testare l’efficienza di questa reazione inversa, abbiamo studiato la fosforolisi di un primer marcato con 5′ 32P annebbiato ad un filamento modello incubandolo con l’enzima e 10 mM Pi. La Fig. 2C mostra la rimozione del nucleotide 3′ terminale dal filamento del primer da parte della Taq DNA polimerasi in presenza di Pi e PPi, dimostrando che la Taq DNA polimerasi può subire la reazione inversa della polimerizzazione del DNA sia da dNTPs che da dNDPs. L’analisi delle polimerasi termofile Bst, Deep Vent, KOD (Fig. S4A), 9°N, Tgo, e le polimerasi mesofile Bsu hanno anche mostrato la fosforolisi del DNA (Fig. S4B), anche se in misura minore. Una reazione di controllo con il frammento Klenow della DNA polimerasi I di Escherichia coli, che non accetta dNDPs come substrato, è stata anche esaminata (Fig. S4C) e ha mostrato che la presenza di PPi, ma non di Pi, provoca l’accorciamento del primer.

Per analizzare ulteriormente la reazione inversa, abbiamo preparato dsDNA marcato internamente con 32P-fosfato eseguendo una reazione di estensione del primer utilizzando α-32P-dATP, seguita da purificazione PAGE. Abbiamo analizzato i prodotti della reazione inversa usando la TLC a scambio anionico (polietileneimina). Come previsto, l’incubazione del DNA marcato internamente con Taq polimerasi e pirofosfato ha prodotto prodotti che si sono combinati con dATP. Reazioni in presenza di fosfato prodotto più veloce-migrante specie, corrispondente a dADP, e reazioni senza fosfato o pirofosfato non ha prodotto alcuna specie migrante, indicando che in presenza di Taq polimerasi solo il DNA è rimasto intatto (Fig. 2D) e confermando che la reazione inversa è fosforolisi del DNA.

Infine, l’analisi della cinetica dipendente dal substrato della reazione inversa ha rivelato un KM di ∼10 ± 5 mM (n = 9) e 57 ± 5 µM (n = 5) per fosfato e pirofosfato, rispettivamente, anche se la bassa solubilità del fosfato di magnesio sopra i 10 mM ci ha impedito di ottenere misure precise (Fig. 2E). Strutture di cristallo di DNA polimerasi con pirofosfato o acido fosfonoformico nei siti attivi mostrano un’interazione Coulomb con la proteina (11⇓-13). Il rapporto di 200 volte tra i KM dei due substrati corrisponde a ∼15 kJ/mol (3,6 kcal/mol) a 72 °C, un’energia di legame approssimativamente uguale a un’interazione ionica tra il fosfato aggiuntivo e un catione di compensazione sulla proteina e che supporta un modello in cui il fosfato/pirofosfato è riconosciuto principalmente attraverso un’interazione carica-carico. Le stime dei tassi massimi della reazione inversa hanno seguito una tendenza simile: a queste condizioni, Vmax era 0,0010 ± 0,0005 s-1 e 0,205 ± 0,005 s-1 per il fosfato e il pirofosfato, rispettivamente, rivelando di nuovo un rapporto di circa 200 volte tra le due attività. Nel complesso, al di sotto delle concentrazioni saturanti dei due substrati, la reazione del fosfato è circa 4 × 104 volte meno efficiente, suggerendo che la fosforolisi del DNA non rappresenta una minaccia significativa per la stabilità del genoma.

Per ottenere ulteriori informazioni sulla sintesi del DNA dai substrati a bassa energia (dNDPs e Pi), abbiamo misurato le energie di attivazione utilizzando l’analisi di Arrhenius delle reazioni in avanti e indietro. Poiché le misurazioni a singola molecola dei cambiamenti conformazionali associati al riconoscimento e all’incorporazione dei dNTP corretti hanno rivelato un movimento proteico più veloce rispetto alla cinetica di reazione osservata (14), il passo limitante della reazione in avanti nella Taq polimerasi è probabilmente legato al passo chimico o a un riarrangiamento pre-catalitico del sito attivo che dipende dall’interazione con i fosfati del substrato. Abbiamo osservato che la Vmax di entrambe le reazioni forward e reverse è più bassa per dNDP e fosfato che per dNTP e pirofosfato, suggerendo che il passo limitante è sensibile allo stato di fosforilazione dei substrati. Tuttavia, sia il riarrangiamento pre-catalitico (come l’allineamento dei residui del sito attivo e il legame di uno ione Mg2+ catalitico) che il passo chimico possono essere influenzati dalla fosforilazione del substrato; quindi, entrambi i passi possono essere limitanti il tasso in presenza di dNDPs, assumendo che non introducano un nuovo passo conformazionale lento nel meccanismo. In Pol β, questi due passi sono stati precedentemente proposti per avere costanti di tasso simili (15), e le energie di attivazione calcolate per le reazioni forward e reverse che utilizzano i substrati ad alta energia (dNTPs e pirofosfato) differiscono solo di 15 kJ/mol (4). Nel caso degli enzimi termofili Taq e Klentaq1, l’energia di attivazione della reazione forward varia ampiamente, variando da 90 a 125 kJ/mol, a seconda delle condizioni sperimentali e probabilmente dell’identità dei nucleotidi che reagiscono (8, 16), mentre l’energia di attivazione della pirofosforolisi non è stata, a nostra conoscenza, determinata sperimentalmente.

Abbiamo analizzato i tassi di incorporazione del singolo nucleotide di 50 µM di dCDP, dADP e dTDP, impilati su dA, dC e dA, rispettivamente, durante la reazione di estensione del primer. Analisi di Arrhenius ha mostrato una dipendenza lineare di ln (kobs) su 1 / T per gli esperimenti sotto i 60 ° C, rivelando energie di attivazione di 85 ± 14, 108 ± 11, e 112 ± 15 kJ / mol per i tre nucleotidi (Fig. 3 A e B; n = 6 per ogni nucleotide). Analisi Arrhenius della reazione inversa con 0,4 mM fosfato, producendo una molecola di dADP, ha rivelato una grande energia di attivazione di 138 ± 10 kJ / mol (n = 5), in linea con il tasso osservato lento di fosforolisi del DNA da Taq (Fig. 3 A e B), e che rappresenta un significativo aumento rispetto all’energia di attivazione calcolato di pirofosforolisi (92 kJ / mol in Pol β) (4). L’energia di attivazione delle reazioni forward e reverse per il dADP differisce quindi di ∼30 kJ/mol, fornendo un forte bias per la sintesi del DNA. Questo bias per la reazione in avanti si traduce in una minore richiesta di sequestro del prodotto fosfato da parte di una via metabolica a valle, in contrasto con la sintesi del DNA basata sul dNTP e l’idrolisi del pirofosfato da parte delle pirofosfatasi inorganiche. Inoltre, se i cambiamenti conformazionali pre-catalitici nella Taq polimerasi non sono influenzati dai substrati a bassa energia e la fase chimica è limitante, l’utilizzo dei dNDP e dei fosfati può fornire nuove informazioni sperimentali sulla catalisi enzimatica della sintesi del DNA.

Il nostro studio dimostra che Taq, e diversi altri enzimi delle famiglie A e B delle DNA polimerasi, compresi gli enzimi replicativi dei batteri termofili e mesofili, possono sostituire i canonici substrati trifosfati con gli analoghi difosfati. Le prime prove della spendibilità del γ-fosfato nel substrato nucleotidico sono emerse dagli studi sulla trascrittasi inversa HIV-1 e sulla DNA polimerasi gp43 del batteriofago RB69. Le varianti di HIV-1 RT che aboliscono l’interazione elettrostatica tra il γ-fosfato del dNTP in arrivo e la polimerasi hanno portato al mantenimento dell’attività, anche se ad un tasso molto più lento (17⇓-19), e la DNA polimerasi gp43 del batteriofago RB69 ha mostrato un’attività simile (20). Entrambi questi enzimi virali accettano dNDPs come substrati, ma con KM (o KD) che sono 500 e 17 volte superiore, e costanti di velocità che sono 100 e 400 volte inferiore a quella per dNTPs dal HIV-1 RT e RB69 gp43, rispettivamente (20, 21). Il nostro studio dimostra che le polimerasi replicative cellulari possiedono questa attività, descrive le affinità del substrato e le energie di attivazione per le reazioni sia in avanti che inversa, e implica che la sintesi del DNA dai dNDP è ragionevolmente efficiente, in particolare per gli enzimi termostabili.

I nostri risultati suggeriscono che la replicazione del DNA può essere realizzata usando i dNDP come substrati. Nei termofili, la replicazione del genoma può essere meno sensibile alla carica energetica della cellula che nei mesofili, perché le polimerasi termostabili possono accettare i substrati difosforilati e trifosforilati. La replicazione del DNA è quindi meno influenzata dal rapporto ATP/ADP intracellulare, e l’efficienza relativamente alta con cui il DNA viene sintetizzato a temperature elevate suggerisce che i termofili possono essere in grado di rinunciare completamente ai substrati trifosforilati. Inoltre, l’evidenza paleobiologica suggerisce che l’ultimo antenato comune della nostra biosfera era un termofilo (22⇓-24), e il nostro studio implica che i substrati disfosforilati potrebbero essere stati sufficienti per la replicazione del genoma dei primi organismi, alleviando la necessità del metabolismo degli intermedi metabolici trifosforilati ad alta energia. In tal caso, i difosfati potrebbero essere considerati intermedi nell’evoluzione dei metaboliti ad alta energia e potrebbero includere i mattoni ancestrali dei primi genomi, come i ribonucleotidi o gli acidi nucleici più semplici.

La DNA polimerasi gioca un ruolo di primo piano in numerose biotecnologie. L’uso di substrati difosfati qui riportato ha il potenziale per rendere pratica l’incorporazione di analoghi costosi, come i nucleotidi marcati isotopicamente o modificati chimicamente, eliminando la necessità di impegnative sintesi di trifosfati. Questa caratteristica delle DNA polimerasi può anche fornire un metodo per rilevare i nucleotidi usati nel sequenziamento del DNA ad alta produttività. Due metodi comuni rilevano il gruppo PPi che lascia associato all’estensione del primer, attraverso un saggio secondario chemiluminescente o monitorando un cambiamento nel pH locale (25, 26). L’uso di un substrato dNDP produce Pi, offrendo così un’ulteriore opportunità per distinguere i nucleotidi incorporati. Questo maggiore apprezzamento delle capacità della DNA polimerasi suggerisce anche che l’esame di altri enzimi trifosfati-dipendenti potrebbe rivelare la tolleranza per substrati difosfati a più bassa energia e di più facile accesso come intermedi evolutivi.