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Il recente editoriale di Dayan e Wraith in questa rivista ha evidenziato le sfide per lo sviluppo di nuove immunoterapie dopo il disastroso trial del TGN1412. Questa panoramica presenta alcune delle conoscenze acquisite da molti studi clinici di anti-D che possono essere rilevanti per l’immunologia traslazionale.

La prevenzione dell’idrope fetale o malattia emolitica di Rhesus del feto e del neonato (HDFN) mediante profilassi anti-D è l’applicazione clinica di maggior successo dell’immunosoppressione mediata da anticorpi. La HDFN si verifica dopo che una donna D-negativa si immunizza ai globuli rossi fetali D-positivi a seguito di un’emorragia fetomaterna (FMH); le IgG anti-D prodotte vengono trasferite attraverso la placenta causando la distruzione dei globuli rossi fetali da parte dei macrofagi splenici. Negli anni ’40, quando la causa di questa malattia fu riconosciuta per la prima volta, l’1% dei bambini nasceva con HDFN e il 40% di essi moriva. L’anticorpo anti-D è il più comunemente implicato. Il polipeptide RhD sui globuli rossi è il più immunogenico degli antigeni del gruppo sanguigno in quanto è assente dalle cellule degli individui D-negativi che mancano del gene RHD.

HDFN è ora raro, in parte a causa del miglioramento delle cure fetali e neonatali, ma soprattutto a causa della prevenzione dell’immunizzazione primaria delle donne D-negative suscettibili con profilassi IgG anti-D. Dal 1968, dopo studi clinici di successo nel Regno Unito e negli Stati Uniti, l’anti-D è stato dato al 10% di tutte le donne postnatali, con una conseguente riduzione dell’incidenza della malattia di circa il 95%. Meno di 30 morti perinatali all’anno sono ora causate dalla HDFN. Nel 2002, il National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE) ha raccomandato la profilassi prenatale di routine anti-D a tutte le donne D-negative, oltre alla profilassi postnatale, per ridurre ulteriormente il tasso di immunizzazione. L’anti-D per via endovenosa (IV) è ora usato anche terapeuticamente per trattare alcuni pazienti D-positivi con porpora trombocitopenica immune (ITP). Quindi la domanda di anti-D è in aumento.

L’immunoglobulina anti-D è preparata da plasma umano iperimmune in pool. Per molti anni, i problemi di sicurezza virologica e, più recentemente, la variante della malattia di Creutzfeld Jacob (vCJD) hanno stimolato la ricerca di forniture alternative. Nel Regno Unito, il plasma per il frazionamento proviene ora da donatori nordamericani a causa dei timori che i donatori britannici siano portatori latenti della vCJD. Con l’obiettivo di sostituire gli anti-D policlonali preparati dal plasma umano con versioni biotecnologiche per uso diagnostico e clinico, sono stati prodotti centinaia di anticorpi monoclonali (mAb) o ricombinanti (rAb) anti-D. Sono tutti derivati da geni di immunoglobuline umane o cellule B perché i topi non riconoscono l’antigene RhD. Sono stati utilizzati vari sistemi di espressione, tra cui linee di cellule B umane, cellule dell’ovaio di criceto cinese (CHO), eteroibridomi topo-umani e mielomi di ratto.

Anche se l’esatto meccanismo di soppressione dell’immunizzazione D mediante somministrazione di IgG passive anti-D deve ancora essere chiarito, è noto che i globuli rossi D-positivi vengono rapidamente eliminati nella milza dai macrofagi mediante interazioni con il recettore IgG Fc (FcγR) e resi non immunogenici. Infatti, per garantire che la profilassi anti-D sia probabilmente efficace nel prevenire l’immunizzazione D a un grande FMH, le donne sono testate 2-3 giorni dopo per verificare che le cellule fetali siano eliminate dalla circolazione . Altrimenti, i globuli rossi allogenici hanno una lunga sopravvivenza dopo FMH o trasfusione. Le risposte alloimmuni sono lente a svilupparsi, in genere 5-15 settimane per l’anti-D . Questo è probabilmente dovuto alla loro mancanza di segnali di pericolo (da molecole estranee) in modo che non sono riconosciuti dal sistema immunitario fino a quando non diventano senescenti, che poi stimola la loro fagocitosi attraverso i recettori della fosfatidil serina. Senza profilassi RhD, circa il 17% delle donne D-negative si immunizza dopo una gravidanza con un feto D-positivo. Questa incidenza è inferiore a quella dei soggetti normali deliberatamente immunizzati (fino a circa l’85% di risposta) perché per la maggior parte delle donne i volumi di FMH sono troppo piccoli perché i globuli rossi siano immunogenici. Le donne incinte possono dare robuste risposte alloimmuni pur tollerando il loro feto semi-allogenico.

Negli ultimi 20 anni, 19 mAbs e rAbs anti-D sono stati testati in 15 studi first-in-man. Questi sono stati recentemente rivisti e sono riassunti qui. Non si sono verificati gravi effetti avversi. I test biologici in vitro della fagocitosi e dell’emolisi mediate dal FcγR utilizzando cellule effettrici umane sono ben stabiliti e sono stati utilizzati per lo screening. Gli studi clinici hanno valutato la capacità degli anticorpi di rimuovere piccoli volumi (meno dell’1%) di globuli rossi D-positivi dalla circolazione e in alcuni studi è stata anche determinata la capacità dell’anti-D di prevenire l’immunizzazione D. Molti dei mAbs e rAbs sono stati confrontati direttamente con gli anti-D policlonali.

Si è osservata una grande eterogeneità nell’efficacia degli anticorpi (tabella 1). Due mAbs derivati da linee cellulari B-linfoblastoidi umane, BRAD-3 e BRAD-5, hanno mediato una rapida clearance dei globuli rossi e hanno impedito l’immunizzazione con D quasi altrettanto efficacemente dell’anti-D policlonale, anche se è stata usata una dose da tre a quattro volte superiore. Le emivite plasmatiche di BRAD-3 e BRAD-5 erano normali ma la biodisponibilità era la metà di quella dell’anti-D policlonale. Quando questi anticorpi sono stati espressi come rAbs in cellule CHO, la clearance dei globuli rossi autologhi D-positivi era più lenta dei mAbs originali. Un grande studio con un altro rAb anti-D derivato da CHO, MonoRho, ha dato risultati deludenti, la clearance dei globuli rossi era estremamente variabile, di solito molto lenta e senza alcuna correlazione con la dose di anti-D. La biodisponibilità molto bassa di MonoRho potrebbe in parte spiegare questo. I soggetti non hanno comunque prodotto anti-D, anche se non sono state fatte iniezioni di sfida di globuli rossi D-positivi per determinare il loro stato di immunizzazione D. I MAbs prodotti da linee cellulari di mieloma murino (come eteroibridomi topo-umani) hanno anche mostrato una grande variabilità nella clearance dei globuli rossi, ma inaspettatamente, oltre la metà dei destinatari si è rapidamente immunizzata a D, il doppio di quanto si sarebbe verificato con i soli globuli rossi. Così questi anti-D hanno avuto un effetto adiuvante, migliorando la risposta immunitaria ai globuli rossi D-positivi invece di impedirla come previsto. Studi successivi utilizzando gli anti-D rAbs prodotti da cellule di mieloma di ratto hanno dimostrato che essi promuovevano una clearance estremamente rapida dei globuli rossi autologhi, più velocemente degli anti-D policlonali. L’effetto di alterare la linea cellulare che esprime FOG-1 dal topo al ratto è stato sorprendente, cambiando la clearance da molto lenta e incompleta a molto veloce. In quest’ultimo studio questo è stato associato a emolisi, un po’ di clearance al fegato e reazioni febbrili. Queste risposte non si verificano dopo la profilassi con anti-D policlonale. Inaspettatamente, i mutanti di FOG-1 rAb, che mancavano di interazioni FcγR in vitro, hanno anche mediato una rapida clearance dei globuli rossi, anche se la sopravvivenza normale era stata prevista. Queste IgG anti-D devono essersi legate a recettori diversi dalle IgG FcγR.

Molti dei mAb e rAb anti-D non si sono comportati come gli anti-D policlonali. Nessuno è stato altrettanto efficace e alcuni da linee cellulari di roditori hanno persino prodotto risposte immunitarie indesiderate. Le risposte in vivo erano determinate principalmente dalla specie di linea cellulare che produceva gli anticorpi e non dalle sequenze proteiche. La causa di queste reazioni inaspettate e possibilmente dannose potrebbe essere perché le IgG anti-D prodotte da cellule animali hanno interagito con componenti del sistema immunitario innato. La spiegazione più probabile è la variazione nella loro composizione oligosaccaridica.

Il tipo di glicosilazione delle IgG dipende dalla cellula in cui sono prodotte ed è specie-specifica. Strutture come l’acido N-glicolico neuraminico e gli oligosaccaridi ad alto contenuto di mannosio sulle IgG dei roditori possono essere riconosciute come estranee dai recettori di riconoscimento del modello immunitario innato (PRR) con successive risposte pro-infiammatorie. I PRR comprendono l’asialoglicoproteina cellulare e i recettori del mannosio. Dopo aver legato l’anti-D sui globuli rossi D-positivi, potrebbero aver stimolato risposte anticorpali all’antigene D. Nel plasma, la lectina legante il mannano può causare l’emolisi mediata dal complemento quando si lega ai residui di mannosio dell’anti-D su un globulo rosso. Gli anticorpi IgG endogeni che riconoscono il galattosio-α1,3-galattosio sulle IgG murine potrebbero legare l’anti-D che esprime questo oligosaccaride. Recentemente, le IgE endogene anti-galattosio-α1,3-galattosio hanno causato reazioni di ipersensibilità in alcuni pazienti a cui è stato somministrato cetuximab (un immunoterapico contro il cancro) prodotto in cellule di mieloma SP2/0 del topo. La mancanza di acido sialico su molti mAbs e rAbs anti-D renderebbe le IgG pro-infiammatorie al momento del legame FcγR.

Gli anti-D policlonali possono essere benefici o letali in diversi contesti clinici. La dose di globuli rossi bersaglio è un fattore importante. La clearance di piccoli volumi di globuli rossi, come nella FMH, è un processo “silenzioso”, non infiammatorio e non emolitico. Se, tuttavia, un individuo D-positivo riceve grandi dosi di anti-D, come in un feto affetto da malattia emolitica RhD o, raramente, in pazienti ITP trattati con IV anti-D, può verificarsi una grave emolisi. In questi casi occasionalmente fatali, i sintomi aggiuntivi sono di solito idrope (edema) in HDFN e emoglobinemia acuta, emoglobinuria e coagulazione intravascolare disseminata in pazienti ITP. La maggior parte dei casi di emolisi acuta sono stati considerati dovuti a una robusta emolisi extravascolare (mediata dai macrofagi) piuttosto che all’emolisi intravascolare. Anche in assenza di tali gravi eventi avversi, i pazienti con ITP non raramente sperimentano febbre e brividi dopo l’infusione di IV anti-D, indicativi di reazioni infiammatorie. Quindi, se i pazienti con ITP fossero trattati con mAbs o rAbs anti-D pro-infiammatori invece degli attuali anti-D policlonali, potrebbe seguire una complessa serie di reazioni non volute e potenzialmente pericolose.

A seguito dello studio TGN1412 di fase 1, alcuni aspetti degli studi clinici di anti-D possono essere utili per il futuro sviluppo e la regolamentazione degli studi first-in-man di altri immunoterapici, specialmente quelli che hanno come bersaglio le cellule del sangue (Tabella 2). La scelta della dose iniziale è particolarmente importante. Basse dosi di globuli rossi e di anti-D sono state utilizzate in tutti i lavori sull’uomo. In alcuni studi, per esempio per BRAD-3, i globuli rossi autologhi (0-5 ml) sono stati rivestiti con anti-D ex vivo poi lavati e iniettati, minimizzando così la dose di anticorpo e mitigando la possibilità di effetti avversi. La clearance di questi piccoli volumi di globuli rossi poteva essere seguita accuratamente quando erano etichettati isotopicamente. Quando questo anticorpo si è dimostrato sicuro ed efficace, l’anti-D e i globuli rossi sono stati iniettati separatamente per simulare più da vicino la situazione clinica. L’evidenza di reazioni infiammatorie con basse dosi di anti-D e globuli rossi dovrebbe assicurare cautela negli studi di scale-up.

In conclusione, i numerosi dati provenienti da studi sull’uomo di mAbs e rAbs anti-D suggeriscono che la loro glicosilazione potrebbe aver avuto un effetto potente nel modulare le loro attività in vivo. Alcuni rAbs hanno aumentato piuttosto che diminuito l’incidenza dell’immunizzazione D, uno ha causato reazioni emolitiche dannose e uno ha avuto una biodisponibilità estremamente bassa. Questi effetti non erano previsti dagli studi in vitro effettuati. In futuro, quando si svilupperanno glicoproteine ricombinanti per la terapia umana, si dovrà considerare la possibilità che si verifichino interazioni tra oligosaccaridi non umani e cellule o molecole diverse dal ligando previsto.