Lo cnidosac nei Cladobranchia
Anatomia comparativa dello cnidosac
Prima del presente studio, sono state fatte numerose ipotesi sull’uniformità della morfologia dello cnidosac tra i cladobranchi che ospitano cleptocnidi. Edmunds in particolare fornisce disegni che sono notevolmente coerenti tra le specie di Fionidae, Favorinidae, Facelinidae e Aeolidiidae, anche se le descrizioni degli cnidosac non erano lo scopo principale di quella pubblicazione. Tutte le specie illustrate in quel lavoro possiedono un chiaro ingresso che collega la ghiandola digestiva con lo cnidosac (anche se in alcuni casi è raffigurato un leggero allungamento dell’ingresso, simile a un canale) e un’uscita distinta sulla punta del ceras che collega lo cnidosac all’esterno. Inoltre, tutti gli cnidosacchi sono rappresentati in possesso di cleptocnidi, e anche il modo in cui la muscolatura è presentata è molto uniforme. Lo studio più dettagliato sugli cnidosacchi aeolidi, fino ad ora, è stato scritto da Kälker e Schmekel, ma non ha descritto sufficientemente la variazione che si può trovare in questa struttura attraverso le circa 600 specie di eolidi. Inoltre, il lavoro sulle strutture simili al cnidosac in Hancockia spp. è iniziato solo di recente.
In questo studio, troviamo che la lunghezza, la dimensione e la struttura dell’ingresso al cnidosac varia più di quanto previsto sulla base del lavoro precedente, così come la struttura dell’uscita, o cnidopore, la muscolatura che circonda il cnidosac, e la posizione e l’orientamento dei cleptocnidi. È importante notare che anche se forniamo un ampio campionamento dei caratteri morfologici dello cnidosac, per molte specie solo un esemplare era disponibile per l’analisi. Come tale, le osservazioni di assenza in alcuni casi devono essere prese con cautela. Discutiamo questi taxa in particolare sotto.
I lavori precedenti presentano solo un ingresso breve e semplice al cnidosac (cioè, un’apertura diretta), probabilmente a causa della selezione di taxa che possiedono questa condizione semplicemente per caso. Il nostro lavoro suggerisce che questa è la transizione più comune tra la ghiandola digestiva e lo cnidosac. Tuttavia, Hancock e Embleton menzionano la presenza di un canale ciliato in Aeolidia (= Eolis) papillosa e Herdman e Clubb notano la presenza di un “lungo, curvo canale di collegamento” in quella che ora è Facelina bostoniensis (= Facelina drummondi). Alcuni taxa possiedono un canale ciliato, tra cui Aeolidia papillosa, Cerberilla amboinensis, Cratena peregrina, Pteraeolidia ianthina, e Paraflabellina ischitana . Questi taxa non sono strettamente correlati, e quindi il canale non è omologo tra i taxa che lo possiedono, suggerendo una spiegazione funzionale per la sua presenza. Inizialmente abbiamo sospettato che la presenza di questo canale allungato fosse legata alla dimensione dei cleptocnidi, poiché A. papillosa, C. amboinensis e P. ianthina sequestrano tutti cleptocnidi più grandi (> 20 μm di lunghezza). Tuttavia, questo non è supportato da C. peregrina e P. ischitana, poiché queste specie sequestrano nematocisti più piccole. In questi casi, il canale ciliato può essere un relitto di un cambiamento ancestrale nella dieta, ma il possibile significato funzionale del canale ciliato rimane speculativo.
Similmente, non c’è un modello coerente tra i taxa che possiedono una zona di proliferazione rispetto a quelli che non lo fanno. L’unica eccezione è l’assenza di una zona di proliferazione nei taxa che non sequestrano le nematocisti del genere Phyllodesmium. L’unica specie del Phyllodesmium in cui abbiamo identificato una zona di proliferazione è P. jakobsenae, che è l’unica specie di Phyllodesmium nota per ospitare cleptocnidi. Non è ancora chiaro perché alcuni taxa sembrano avere una zona di proliferazione mentre altri no, ma sospettiamo che in un piccolo numero di casi gli artefatti del sezionamento di alcuni campioni abbiano portato alla distruzione di questa regione (probabilmente a causa di difficoltà di conservazione), che porta a frammenti di membrana e cleptocnidi fluttuanti all’interno degli cnidosacchi di alcune specie (ad esempio, Cratena peregrina; Fig. 4d). Per affrontare questo punto, dovrebbero essere studiati più individui di queste specie. L’apparente assenza di una zona di proliferazione può anche essere dovuta a differenze nello stadio di crescita degli individui indagati, o dei cerata se alcuni erano in fase di rigenerazione, ma non abbiamo trovato alcuna prova che supporti esplicitamente nessuna di queste ipotesi. Inoltre, almeno uno studio precedente ha menzionato la presenza di questa regione, ma non è stata discussa in dettaglio. Questa regione è dove le nematocisti vengono prese dagli cnidofagi prima di migrare verso l’estremità distale dello cnidosac. Tuttavia, l’estensione precisa della zona di proliferazione rimane poco chiara. In alcune specie, sembra essere limitata allo cnidosac (ad esempio, Pteraeolidia ianthina; Fig. 4a), ma in altre questa zona sembra estendersi nelle parti adiacenti della ghiandola digestiva (ad esempio, Dondice occidentalis; Fig. 4b). Nella maggior parte dei taxa che sequestrano nematocisti, abbiamo trovato solo uscite molto semplici dal cnidosac, che in alcuni casi è coperto da un sottile epitelio. Questo rivestimento contiene cellule simili a quelle dell’epidermide dei cerata, che è composta da cellule colonnari allungate con quelli che sembrano essere molti vacuoli specializzati. Le uscite semplici sono le più comuni, sia nel nostro studio che apparentemente in altri. Tuttavia, in alcuni taxa selezionati all’interno Aeolidiidae, tra cui Aeolidia papillosa, Anteaeolidiella chromosoma, e Cerberilla amboinensis, un cnidopore complesso è presente (Fig. 4c). Porta un rivestimento epiteliale che appare continuo con quello dell’epidermide. Questa struttura è stata identificata in precedenza, ma era considerata semplicemente una zona di cellule indifferenziate che si credeva servisse da riserva per gli cnidofagi persi. Tuttavia, a causa della posizione all’estremità distale del cnidosac, e come parte del cnidopore, sospettiamo che questo non sia il caso. Invece, ipotizziamo che questo strato cellulare sia un adattamento speciale per rilasciare le nematocisti eccezionalmente lunghe e strette sequestrate dagli anemoni (fino a 50-60 μm di lunghezza, ma < 5 μm di larghezza). Il termine cnidopore è stato precedentemente usato acriticamente per riferirsi a tutte le uscite dal cnidosac, ma ora ridefiniamo il termine cnidopore qui per riferirsi alla struttura finora trovato solo in Aeolidiidae.
Anche se la muscolatura che circonda il cnidosac varia anche attraverso Aeolidida, il significato di questa variazione non è chiaro. La muscolatura intorno al cnidosac è molto sottile o manca del tutto solo in poche specie, tra cui Embletonia gracilis, Embletonia pulchra e Bulbaeolidia alba. Quando è presente, lo spessore del muscolo varia tra le specie, andando da quello che sembra essere uno a più strati. Questa variazione nello spessore della muscolatura è illustrata in uno studio precedente, anche se non con la precisione che indichiamo qui (Tabella 3). Non c’è una spiegazione evolutiva ovvia per la variazione dello spessore del muscolo o del numero di strati muscolari tra i taxa, ma uno strato muscolare più spesso probabilmente risulterebbe in un’espulsione più forte dei cleptocnidi. L’aumento della muscolatura potrebbe essere associato alla pressione di predazione, alle dimensioni dei cleptocnidi incorporati o allo stadio di sviluppo. La differenziazione degli cnidofagi da una cellula funzionale e attiva in un “contenitore o dispensa” di cleptocnidi all’estremità dello cnidosac riflette la maturazione dei cleptocnidi attraverso il trasporto protonico, che sono immaturi e non funzionali quando vengono sequestrati. Dopo la maturazione, le cellule sembrano non avere ulteriore funzionamento a causa della riduzione della complessità cellulare. Lavoratori precedenti hanno cercato di affrontare l’origine della membrana dello cnidofago , e recentemente hanno concluso che è un fagosoma, una vescicola specializzata formata dalla membrana cellulare . All’interno degli cnidofagi, il numero di cleptocnidi può variare sia all’interno che tra i taxa. Questo sembra essere associato alla dimensione dei cleptocnidi; tendono ad esserci meno cleptocnidi grandi (> 20 μm di lunghezza) all’interno di un dato cnidofago rispetto a quelli con cleptocnidi più piccoli (solitamente 10 μm o meno). Un esempio può essere trovato in Pteraeolidia ianthina (Fig. 4a), che sequestra nematocisti di più classi di dimensioni.
Divergenze dal tema generale
I caratteri morfologici valutati in questo studio sembrano essere abbastanza variabili all’interno delle famiglie, ma la maggior parte degli cnidosacchi varia generalmente su un tema che è conservato in tutti gli Aeolidida. Tuttavia, ci sono ancora altri che hanno perso particolari strutture cnidosac o hanno perso il cnidosac del tutto. Si potrebbe ipotizzare che gli cnidosacchi perdano la connessione con la ghiandola digestiva o la muscolatura che circonda lo cnidosacco quando non ci sono nematocisti sequestrate. Per esempio, le specie del genere Phyllodesmium (eccetto P. jakobsenae) possiedono cnidosacchi legati alla muscolatura che sembrano essere privi di cleptocnidi, ma non ci sono entrate evidenti al diverticolo digestivo o uscite verso l’ambiente esterno. Piuttosto, queste specie sequestrano sostanze chimiche per la difesa, e quindi non richiedono necessariamente un ingresso strutturato. In questo modo, gli cnidosacchi in Phyllodesmium possono essere simili alle formazioni dermiche del mantello in Charcotiidae, che mancano di un’uscita ma rilasciano il contenuto quando vengono compresse. Tuttavia, nelle specie del genere Favorinus, la struttura generale dello cnidosac (compresa l’apertura dalla ghiandola digestiva e i muscoli intorno allo cnidosac) rimane la stessa, ma non sono presenti cleptocnidi a causa della propensione di queste specie a nutrirsi delle uova di altri gasteropodi. Anche se è possibile che la mancanza di cleptocnidi possa derivare da un’ipotetica propensione in Phyllodesmium e Favorinus a scaricare nematocisti durante il processo di fissazione, suggeriamo che questo è improbabile. Per esempio, i membri di Phyllodesmium sembrano avere un epitelio intatto dove ci si potrebbe aspettare che i cleptocnidi vengano espulsi. Se i cleptocnidi venissero espulsi durante la fissazione, i ceras sarebbero fissati con un’apertura nella punta. Inoltre, l’assenza di cleptocnidi in Phyllodesmium in particolare è anche ben documentata (con l’eccezione di P. jakobsenae). In Favorinus, è possibile che questo sia il caso, dato l’epitelio aperto sulla punta dei cerata (ad esempio, Fig. 2c), ma l’assenza di cleptocnidi è coerente con l’abitudine dei membri di questo genere di mangiare uova di gasteropodi.
Anche più variazioni su questo tema si trovano in Bulbaeolidia alba, Embletonia spp. Bulbaeolidia alba ha una sacca all’estremità distale della ghiandola digestiva che contiene solo occasionalmente zooxantelle (Symbiodinium). Inoltre, non siamo riusciti a trovare alcun ingresso o uscita evidente da o verso il sacco, e la struttura sembra essere circondata da alcune sottili fibre muscolari. Abbiamo ipotizzato che la mancanza di cleptocnidi possa essere dovuta alle dimensioni molto piccole di B. alba, che potrebbe quindi possedere una minore esigenza di difesa, ma anche taxa più piccoli all’interno dei generi Embletonia e Pseudovermis possiedono cleptocnidi. In alternativa, ipotizziamo che la mancanza di sequestro possa essere legata alla dimensione o all’utilità delle nematocisti trovate all’interno degli anemoni di cui questa specie si nutre. Una terza alternativa è che B. alba invece ospita altri composti naturali all’interno di questo sacco, sia dalle sue prede come in Phyllodesmium o prodotti de novo. Ancora una volta, è possibile che la mancanza di cleptocnidi in B. alba sia un artefatto di una piccola dimensione del campione, ma come Phyllodesmium, non è stata trovata alcuna prova di estrusione. I membri di Embletoniidae sembrano aver evolutivamente perso la muscolatura che circonda il cnidosac interamente o rappresentano un passo intermedio nell’evoluzione del cnidosac, come discusso nella sezione sull’evoluzione del cnidosac qui sotto. In questi taxa non c’è nemmeno un’entrata o un’uscita evidente da e verso lo cnidosac. Infine, alcune specie di Fionidae all’interno del genere Fiona (questo studio) hanno perso gli cnidosacchi interamente, apparentemente perché le specie di questo genere preferiscono prede non-cnidari.
Le nematocisti sequestrate sono state trovate anche in un’altra famiglia di Cladobranchia, Hancockiidae. In Hancockia californica vediamo strutture molto simili agli cnidosacchi (che noi chiamiamo cnidosacchi), con cleptocnidi alloggiati in cellule simili a cnidofagi in sacche muscolari multiple sulla punta di ogni ceras. Queste strutture sono state trovate anche in Hancockia uncinata e H. schoeferti , e in alcuni casi strutture simili a cnidosac sono state trovate sia nei cerata che nelle guaine rinophorali. Le inferenze omologiche riguardanti le strutture trovate in Hancockiidae e quelle in Aeolidida sono discusse nella prossima sezione.
Filogenesi dei Cladobranchia ed evoluzione dello cnidosac
Indicazioni filogenetiche
Dato che molti dei dati molecolari qui inclusi sono derivati da studi precedentemente pubblicati, la topologia dedotta nella nostra analisi filogenetica (Figura 5) è coerente con quella trovata in entrambi i recenti studi filogenomici. Tuttavia, questo lavoro estende i risultati precedenti includendo taxa non analizzati nei recenti studi filogenomici, vale a dire taxa dai generi Phyllodesmium, Caloria, Pruvotfolia, Pteraeolidia, Cratena, Facelina, Glaucus, Calmella, Piseinotecus, Tergipes, Notaeolidia, Embletonia e Charcotia. La maggior parte di questi rientrano nei cladi che ci aspetteremmo sulla base del lavoro molecolare precedente: Phyllodesmium è strettamente legato a Dondice all’interno del clade dei facelinidi che è sorella di Aeolidiidae; Caloria è supportata all’interno del secondo clade dei facelinidi ed è strettamente legata alle specie di Pruvotfolia; Facelina, Glaucus e Cratena sono strettamente legati all’interno del secondo clade dei facelinidi; Calmella è strettamente legata a Flabellina e Paraflabellina; e Tergipes rientra in quello che ora è Fionidae . Tuttavia, il posizionamento di Pteraeolidia come strettamente correlato a Palisa e Austraeolis all’interno del secondo clade di facelinidi è nuovo per questo studio, e i dati molecolari presentati qui supportano la posizione di Charcotia all’interno del gruppo sorella di Aeolidida, come suggerito in precedenza dal lavoro morfologico.
Nonostante l’aggiunta di tutti i nuovi dati presentati qui, le posizioni di Notaeolidia e Embletonia rimangono poco chiare. Il supporto per le posizioni esatte di questi due generi è scarso, e questi taxa sembrano contribuire ai bassi valori di bootstrap alla base di Aeolidida. Ciò può essere dovuto all’attrazione dei rami lunghi tra Notaeolidia e Flabellinopsis iodinea, e tra Embletonia e Unidentia. Tuttavia, le analisi morfologiche sostengono anche almeno la divergenza precedente di Notaeolidia all’interno di Aeolidida . L’incertezza che circonda le affinità di questi quattro taxa ha implicazioni per la nostra comprensione dell’evoluzione del cnidosac.
Troviamo anche che le analisi degli alberi dei singoli geni (e l’analisi dei tre geni) sono coerenti con le precedenti analisi di sequenza su larga scala basate sulla PCR. Queste topologie e probabilità posteriori supportano l’idea che i dati di sequenziamento basati sulla PCR per i geni utilizzati (COI, 16S e 18S) forniscono una certa utilità per dedurre le divergenze recenti, ma che i dati di sequenziamento ad alta produttività sono necessari per dedurre divergenze più profonde.
Evoluzione degli cnidoschi
Il sequestro delle nematocisti degli cnidari ha avuto origine almeno due volte all’interno dei Cladobranchia in base alla filogenesi qui presentata (Fig. 6). Questo risultato indica anche che le specie all’interno di Aeolidida che non sequestrano le nematocisti hanno perso questa capacità, il che sembra essere avvenuto almeno tre volte. Inoltre, la divergenza precoce di Embletoniidae all’interno della filogenesi degli Aeolidida è suggestiva; indica che la struttura all’interno di Embletoniidae è uno cnidosac, e che la mancanza di muscolatura intorno allo cnidosac può rappresentare un passo intermedio nell’evoluzione del sequestro dei cleptocnidi. Tuttavia, è necessario un supporto più forte per le relazioni alla base di Aeolidida prima di poter fare ulteriori deduzioni. I nostri risultati supportano anche diverse perdite indipendenti del cnidosac, anche nei membri di Fiona e Tergipes. Questo sembra essere dovuto a un passaggio a predare principalmente su Crustacea in Fiona. Una transizione di preferenza preda da idroidi ad altri tipi di organismi può anche aver portato alla perdita di cnidosacs in alcune specie di Tergipes .
La presenza di un sacco all’estremità distale della ghiandola digestiva è ipotizzato di aver avuto origine prima della capacità di sequestrare nematocisti (Figura 6; riquadro grigio), anche se questo risultato si basa sull’ipotesi che i sacchi terminali trovati in Charcotiidae e Proctonotidae sono omologhi a quelli in Aeolidida. Il supporto per questa ipotesi è molto basso, e quindi appare improbabile sulla base della nostra ricostruzione. Tuttavia, i sacchi terminali di Charcotiidae e Proctonotidae sono considerati funzionare come strutture escretrici, e alcuni hanno ipotizzato che il cnidosac degli eolididi sia un adattamento di questo sacco per la difesa. Anche se l’omologia rimane incerta, la nostra ricostruzione dello stato ancestrale non respinge completamente questa ipotesi di modifica, in cui il sacco distale è stato adattato per sequestrare le nematocisti. Ulteriori dati morfologici e molecolari da ulteriori specie nel clade Charcotiidae + Proctonotidae + Dironidae sono necessari per testare ulteriormente questa ipotesi, in quanto questo clade non è ben rappresentato nella nostra analisi, che può ostacolare le inferenze evolutive.
Le strutture simili al cnidosac in Hancockiidae sembrano essersi evolute indipendentemente dal sacco distale sia in Aeolidida che nel suo clade sorella. Questo è supportato dalle analisi filogenetiche presentate qui, nonché dalle differenze nel processo di sequestro tra Hancockia e le specie di eolidi. Per esempio, sembra che le specie di Hancockia incapsulino le nematocisti nel lume del tratto digestivo prima del trasporto, a differenza degli aeolidi.