Abstract
Sono stati valutati gli effetti dell’Arnica montana 6cH sulla modulazione individuale della cinetica dell’infiammazione acuta nei ratti. Ratti adulti maschi Wistar sono stati inoculati con 1% di carragenina nella pianta del piede e trattati con Arnica montana 6cH, desametasone (4.0 mg/kg; controllo positivo) o soluzione idroalcolica al 5% (controllo negativo), per os, ogni 15 minuti, tra 30 e 180 minuti dopo l’inoculazione irritante. Sono state effettuate procedure istopatologiche e immunoistochimiche per ottenere un pannello di cellule infiammatorie positive per CD3 (linfociti T), CD45RA (linfociti B), CD18 (beta 2 integrina), CD163 (proteina ED2), CD54 (ICAM-1) e MAC 387 (monociti e macrofagi). Il trattamento statistico dei dati ha incluso la classificazione a posteriori degli animali di ogni gruppo () in due sottogruppi che presentavano un edema spontaneo precoce o tardivo. Gli animali che presentavano un edema precoce erano meno responsabili di Arnica montana 6cH in relazione ai cambiamenti emodinamici. Invece, i ratti che presentavano un edema tardivo presentavano un edema meno intenso (), una percentuale inferiore di degranulazione dei mastociti (), e un aumento del diametro dei vasi linfatici (). I dati suggeriscono una regolazione qualitativa individuale degli eventi infiammatori vascolari da parte di Arnica montana 6cH.
1. Introduzione
Una delle controversie più discusse sull’efficacia dei farmaci omeopatici è la necessità di individuare una perfetta analogia sintomatica tra paziente e patogenesi del farmaco, cioè la necessità della prescrizione individuale secondo il principio di similia. Questa particolare caratteristica è una delle sfide più difficili della ricerca scientifica in questo campo a causa della difficoltà tecnica della sua dimostrazione sperimentale. Infatti, pochi studi sperimentali in merito si trovano in letteratura. Pertanto, la dimostrazione sperimentale di questa particolarità e la comprensione dei suoi meccanismi possono essere strumenti utili per risolvere le controversie croniche sull’efficacia dell’omeopatia, spesso osservate negli studi clinici. Recentemente, un elegante studio in vitro ha dimostrato l’importanza dei meccanismi cellulari regolatori e adattativi nell’entità dei rimedi omeopatici che inducono effetti citotossici sulle cellule tumorali.
Dal 1997 al 2008, abbiamo sviluppato una ricerca graduale sugli effetti biologici dell’Arnica montana omeopatica, specialmente l’Arnica montana 6cH, utilizzando modelli animali. In breve, i risultati ottenuti in questi studi dimostrano che l’Arnica montana 6cH è in grado di modulare il processo infiammatorio acuto nei ratti, poiché può aumentare l’assorbimento dell’edema linfatico e il flusso sanguigno locale, nonché promuovere la matrice della migrazione delle cellule polimorfonucleate. Tutti questi esperimenti sono descritti cronologicamente in .
L’Arnica montana è una pianta appartenente alla famiglia delle Compositae che cresce sulle colline dell’Europa orientale e centrale. Diversi composti attivi sono identificati nelle sue foglie, fiori e radici, come alcoli, tannini, flavonoidi e lattoni sesquirterpenici, specialmente l’helenalina. L’azione principale dell’helenalina è l’inibizione del fattore di trascrizione NFκβ, similmente agli steroidi corticoidi. L’ingestione accidentale della pianta può causare vasodilatazione, stasi sanguigna, emorragia, edema e dolore. Questi effetti sono i principali argomenti descritti nell’Arnica montana materia medica. Per questo motivo, il dolore da trauma e l’assorbimento dell’edema sono le principali indicazioni per l’uso clinico e sperimentale dei preparati omeopatici di Arnica montana. Recentemente, altri usi di Arnica montana altamente diluita sono stati proposti, come l’uso agronomico di Arnica nelle potenze 3, 6, e 12cH per migliorare la crescita delle piante
Lo scopo del presente studio era quello di verificare due ipotesi: (a) la modulazione putativa degli eventi vascolari e cellulari nell’infiammazione acuta da parte di Arnica, concentrandosi sul tasso di neutrofili, monociti, linfociti T e B presenti nel sito infiammatorio, e l’intensità di espressione delle molecole di adesione nel tessuto connettivo infiammato, utilizzando tecniche immunoistochimiche e istomorfometriche; (b) l’interferenza putativa sulle uscite delle naturali variazioni individuali della cinetica dell’infiammazione.
2. Materiale e metodi
2.1. Animali
Sono stati utilizzati ratti Wistar maschi adulti, di peso compreso tra 250 e 300 g. I ratti sono stati mantenuti in gabbie convenzionali in polipropilene da laboratorio (da 5 a 7 animali per gabbia), con temperatura controllata (25 ± 3°C) e ciclo di luce (luci accese dalle 06:00 AM alle 06:00 PM). Acqua e cibo sono stati offerti ad libitum. Prima dell’inizio dell’esperimento, gli animali sono stati pesati a caso, separati e identificati in tre gruppi di 20 ratti ciascuno.
2.2. Induzione dell’infiammazione acuta
Il processo infiammatorio acuto è stato indotto dall’inoculazione sottocutanea di carragenina kappa 1% (SIGMA) diluita in soluzione fisiologica sterile nella pedana, il cui spessore è stato precedentemente misurato con un micrometro (MYTUTOYO).
Dopo 30 e 180 minuti, sono state effettuate nuove misurazioni, al fine di valutare l’evoluzione dell’edema pre e post trattamento in funzione del tempo. Così, i primi 30 minuti hanno misurato la formazione spontanea dell’edema e i restanti 150 minuti hanno misurato gli effetti del farmaco, poiché i trattamenti sono stati fatti dopo la misurazione di 30 minuti. A 180 minuti, gli animali sono stati eutanasizzati per trazione cervicale in anestesia profonda, e i cuscinetti dei piedi sono stati raccolti e fissati in formaldeide tamponata al 10% per 24 ore al massimo, prima di essere trattati con tecniche istologiche convenzionali, compresa l’inclusione di paraffina, ematossilina-eosina e colorazione blu toluidina. Gli stessi blocchi di paraffina sono stati utilizzati per eseguire le procedure immunoistochimiche. Per ogni pedana, è stato fatto un singolo vetrino.
2.3. Gruppi e trattamenti
Ogni gruppo di ratti è stato trattato con una sostanza specifica, secondo la tabella 1. I ratti trattati con Arnica montana 6cH (sperimentale) e la soluzione idroalcolica al 5% non utilizzata (controllo negativo) ottenuta dallo stesso fornitore sono stati identificati da codici, in modo che tutti i trattamenti e le misurazioni fossero fatte in cieco. Questi codici sono stati creati da un tecnico di laboratorio che non ha partecipato allo studio e conservati in un foglio sigillato fino all’analisi statistica, quando sono stati rivelati.
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I ratti trattati con desametasone (controllo positivo) sono stati fatti apertamente, a causa delle caratteristiche fisiche della formulazione usata; era molto diversa da quella omeopatica e, quindi, facilmente riconoscibile. Il trattamento e l’analisi microscopica dei campioni sono stati eseguiti da due persone indipendenti, sempre in cieco. La dose totale di desametasone utilizzata per produrre effetti antinfiammatori era di 4 mg/kg, secondo gli standard definiti in precedenza. Questo protocollo frazionato è stato progettato per riprodurre una condizione clinica abituale omeopatica di trattamento dell’infiammazione acuta ed è stato utilizzato anche negli studi precedenti eseguiti dal nostro gruppo. Il desametasone è stato scelto come gruppo di controllo positivo perché il suo meccanismo d’azione imita quello dell’elenalina, il principale principio attivo dell’Arnica montana.
L’Arnica montana commerciale 6cH è stata preparata in soluzione idroalcolica al 5% da una farmacia certificata dall’Agenzia Nazionale Brasiliana di Vigilanza Sanitaria (ANVISA), Farmácia Sensitiva, São Paulo. Le tecniche utilizzate nella preparazione erano secondo la Farmacopea Omeopatica Brasiliana, 2a Edizione, 1997.
2.4. Analisi dei dati
Dopo il primo grafico dell’intensità dell’edema ottenuto durante il periodo di pretrattamento (da zero a 30 minuti), i dati sono stati classificati in ordine crescente utilizzando un software Excel 2003, in modo che fosse possibile dividere, per ogni gruppo, i 10 ratti (50%) che presentavano spontaneamente un’intensità di edema inferiore e i 10 ratti (50%) che presentavano un’intensità di edema superiore. Così, due sottogruppi di 10 animali sono stati formati per ogni gruppo sperimentale, caratterizzando due diverse sottopopolazioni di ratti secondo il modello cinetico infiammatorio (Tabella 2). L’intero disegno sperimentale è spiegato in un diagramma di flusso (Figura 7).
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Siccome la curva classica dell’edema indotto da carragenina si estende fino a 6 ore dopo l’inoculazione, la scelta di entrambi i tempi (30 e 180 minuti) si è basata sul suo noto plateau. Inoltre, studi precedenti sugli effetti di Arnica 6cH sull’edema indotto da carragenina non mostrano più effetti dopo questo periodo. La cinetica di valutazione del processo infiammatorio dopo l’iniezione di carragenina è un modello sperimentale classico sviluppato durante gli anni 70. Quindi, è un criterio affidabile da utilizzare in questo caso.
Dopo aver tracciato i dati (figure 1(a) e 1(b)), entrambi i modelli cinetici sono diventati facili da identificare: (a) gli animali che presentavano un edema meno intenso durante i primi 30 minuti di pretrattamento avevano il picco tra 30 e 180 minuti (chiamato edema tardivo) e (b) quelli che presentavano un edema più intenso nei primi 30 minuti diminuivano dopo questo periodo (chiamato edema precoce).
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Edema (mm) in diversi gruppi e sottogruppi. (a) evoluzione dell’edema in funzione del tempo nel sottogruppo edema precoce; (b) evoluzione dell’edema in funzione del tempo nel sottogruppo edema tardivo; (c) intensità dell’edema alla fine dell’esperimento nel sottogruppo edema precoce; (d) intensità dell’edema alla fine dell’esperimento nel sottogruppo edema tardivo; ANOVA, Tuckey-Krammer, in relazione al controllo. I valori rappresentano la media ± deviazione standard.
Tutti i risultati sono stati confrontati tra i sei sottogruppi. Questa selezione a posteriori è stata fatta per verificare il ruolo dell’idiosincrasia individuale nell’effetto dell’Arnica secondo il principio di similia, poiché la velocità di remissione dell’edema è uno dei sintomi più noti dell’Arnica montana descritti nella materia medica.
2.5. Analisi immunoistochimica
Tutti i vetrini sono stati lavati con una soluzione di alcool ed etere 1 : 1 per cinque minuti e poi asciugati con un foglio di carta morbida e trattati con poli-L-lisina 1 : 10 (SIGMA). Poi, fette di tessuto in paraffina da 5 micron sono state trasferite sulla loro superficie usando un bagno istologico a 40°C. Successivamente, le fette sono state deparaffinate attraverso due bagni in xilolo assoluto per 2 minuti e due bagni in alcol assoluto per 3 minuti. I vetrini sono stati, poi, lavati in acqua corrente del rubinetto.
Per le procedure di immunoistochimica, un primo passo per il recupero dell’antigene è stato fatto utilizzando il trattamento termico dei campioni. I vetrini sono stati messi in un bagno di tampone citrato (SIGMA), pH = 6,0, contenente 0,5% tween 20 (DAKO), e riscaldati in una pentola elettrica a 80°C (PANASONIC) per 20 minuti. Dopo di che, i vetrini sono stati lavati in PBS, pH = 7.2 (SIGMA), per 6 minuti e asciugati con una carta assorbente morbida, e il campione di tessuto è stato delimitato usando una penna appropriata (Pap-pen, AbCam).
L’attività endogena della perossidasi è stata bloccata dall’incubazione dei tessuti in una soluzione di H2O2 al 3% diluita in metanolo (ISOFAR), per 15 minuti a temperatura ambiente. Poi, sono stati lavati in PBS (SIGMA) per 6 minuti e trattati con 2,5% di siero normale di cavallo (VECTOR) per 20 minuti a 25°C, per bloccare i siti di legame proteico aspecifici. Subito dopo questo passaggio, i tessuti sono stati trattati con l’anticorpo primario (vedi diluizioni e specifiche nella tabella 3) e lasciati in piedi per una notte a 4°C in una camera umida. Tutte le diluizioni degli anticorpi primari sono state fatte in 1% di sieroalbumina bovina (BSA).
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Il giorno successivo, i tagli sono stati lavati in PBS (sigma) per 6 minuti e trattati con l’anticorpo secondario coniugato alla perossidasi polimerica (IMPRESS UNIVERSAL, VECTOR), a 25°C per 30 minuti. Dopo un nuovo lavaggio in PBS (6 minuti), sono stati esposti a DAB (DAKO) per 3 secondi, lavati ancora una volta in acqua di rubinetto, colorati con ematossilina Harris (01 minuto), e montati.
2.6. Istomorfometria
Per la valutazione della percentuale di degranulazione dei mastociti, sono state contate duecento cellule per vetrino colorate con il metodo blu di Toluidina, utilizzando campi contigui, differenziando i degranulati da quelli non degranulati. Per valutare il diametro dei vasi linfatici, cinque campi scelti a caso sono stati valutati con un obiettivo 200 x. Sono state fatte fotomicrografie di ogni campo (CANNON), e la percentuale di area dei vasi linfatici per campo è stata determinata da un sistema di analisi digitale delle immagini (Image Tool 3.0). Il diametro dei vasi linfatici può essere considerato un buon parametro per valutare l’assorbimento dell’edema linfatico, secondo osservazioni precedenti. Poiché il protocollo riguardava eventi acuti, l’ipotesi della linfangiogenesi non è stata considerata.
Per i marcatori anti-CD45RA, CD3, CD18, CD163 e MAC 387, sono stati osservati dieci campi microscopici scelti a caso per diapositiva, utilizzando un obiettivo ad immersione (magnitudine 1000 x). Essi comprendevano quasi tutti i tessuti connettivi vascolari sottocutanei del tampone, e il numero di cellule positive per campo è stato registrato. Nel caso dell’Anti-MAC 387, sono state considerate solo le cellule mononucleate positive. I vetrini colorati con ematossilina-eosina sono stati utilizzati per contare il numero di cellule PMN per campo. In questo caso, il riconoscimento delle cellule è stato fatto solo con criteri morfologici. L’espressione di CD163 è proporzionale alla maturazione dei macrofagi, per cui questi risultati sono stati espressi come il rapporto tra CD163/MAC 387 cellule mononucleate positive per campo.
Per l’Anti-CD54, l’intensità della positività sulla superficie delle cellule endoteliali è stata valutata con un sistema di punteggio, che varia da 1 a 4. Cinque campi scelti a caso sono stati valutati per vetrino, utilizzando l’obiettivo a immersione (magnitudine 1000 x), e i punteggi sono stati fatti da due osservatori indipendenti, in modo cieco, per evitare l’interpretazione soggettiva nell’analisi. Il punteggio finale per ogni vetrino era uguale alla somma dei punteggi parziali. I criteri di classificazione dei punteggi sono rappresentati nella tabella 4.
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2.7. Analisi statistica
Il test di Bartlett è stato prima impiegato per determinare la distribuzione gaussiana della maggior parte dei punti dati. Poi, ANOVA/Tuckey-Krammer o Kruskall-Wallis/Dunn è stato eseguito, secondo i risultati di Bartlett. La valutazione della degranulazione dei mastociti, invece, è stata valutata tramite test. I valori di sono stati considerati significativi. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software INSTAT 3.
In relazione all’edema, è stata eseguita anche un’ulteriore analisi statistica intragruppo e il confronto dell’intensità dell’edema tra i sottogruppi a 30 minuti (edema spontaneo) ha rivelato differenze significative (Tuckey-Krammer, ), convalidando il disegno sperimentale proposto.
2.8. Criteri bioetici
Il protocollo è stato approvato dal Comitato di bioetica dell’Universidade Paulista (protocollo 011/07), secondo la legge dello Stato di San Paolo n. 11.977/05 (Codice di protezione degli animali dello Stato di San Paolo, Brasile). Questa procedura è conforme alla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati a fini sperimentali e ad altri fini scientifici e la sua appendice.
3. Risultati
L’aspetto istopatologico delle piante dei piedi infiammate ha rivelato il quadro classico di una tipica infiammazione acuta iniziale: edema e infiltrato cellulare corrispondente a 2/3 di cellule PMN e 1/3 di cellule mononucleate. Tuttavia, considerando il trattamento statistico intragruppo, è stato possibile identificare l’esistenza di diversi modelli di sviluppo del processo infiammatorio in funzione del tempo (tabelle 5 e 6). Quindi, c’era la necessità di sistematizzare e classificare questi modelli prima di analizzare gli effetti di Arnica montana 6cH.
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| media ± deviazione standard; millimetri. bmean ± deviazione standard; pixel per campo. cmediana e intervallo; punteggi attribuiti da due osservatori indipendenti. media ± deviazione standard; cellule per campo. |
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| media ± deviazione standard; millimetri. bmedia ± deviazione standard; pixel per campo. media e intervallo; punteggi attribuiti da due osservatori indipendenti. media ± deviazione standard; cellule per campo. |
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Secondo ciò, un effetto antiedematoso significativo di Arnica montana 6cH potrebbe essere visto (ANOVA, ) solo nel sottogruppo di ratti che ha presentato il picco di edema tra 30 e 180 minuti dopo l’iniezione di carragenina nella pedana (chiamato sottogruppo tardivo) (Figura 1). Inoltre, l’analisi istomorfometrica dei vetrini colorati con blu di Toluidina ha rivelato che il sottogruppo tardivo presentava anche una degranulazione dei mastociti meno intensa (, ) e un diametro medio maggiore dei vasi linfatici (Kruskal-Wallis, ). Invece, nel sottogruppo precoce (picco dell’edema prima dei 30 minuti), è stato osservato solo un aumento discreto ma significativo della degranulazione dei mastociti (, ), così come un aumento dei punteggi di espressione del CD54 da parte delle cellule endoteliali (Kruskal-Wallis, ) (Tabelle 5 e 6, Figure 2 e 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Iistogramma che rappresenta la percentuale di mastociti degranulati e area linfatica (pixel) per campo. (a) Sottogruppo che ha sviluppato un edema precedente; (b) sottogruppo che ha sviluppato un edema successivo. in relazione al controllo. **Kruskal-Wallis, in relazione al gruppo desametasone.
Nessuna differenza tra gruppi e sottogruppi è stata osservata per quanto riguarda la migrazione cellulare, considerando le cellule PMN e tutti i marcatori utilizzati nell’analisi immunoistochimica, compreso il rapporto cellule CD 163+/MAC 387+ (tabelle 5 e 6, figure 3, 4 e 5).
(a)
(b)
(a)
(b)
Histogramma rappresentante il numero di cellule MAC387 positive per campo, il rapporto CD163/MAC387 e il numero di cellule polimorfonucleate per campo. (a) Sottogruppo che ha sviluppato un edema precedente; (b) sottogruppo che ha sviluppato un edema successivo. ANOVA, senza significatività.
(a)
(b)
(a)
(b)
Iistogramma che rappresenta il numero di cellule CD3 e CD45R positive per campo. (a) Sottogruppo che ha sviluppato un edema precedente; (b) sottogruppo che ha sviluppato un edema successivo. ANOVA, senza significatività.
(a)
(b)
(a)
(b)
Iistogramma che rappresenta il numero di cellule positive al CD18 (beta 2 integrina) per campo e la mediana (intervallo) dei punteggi di marcatura del CD54 (ICAM). (a) Sottogruppo che ha sviluppato un edema precedente; (b) sottogruppo che ha sviluppato un edema successivo. ANOVA, senza significatività; *Kruskal-Wallis/Dunn, in relazione al controllo.
Prendendo tutti i dati insieme, è possibile illustrare la conclusione principale con un grafico a dispersione dell’intensità dell’edema, in cui si possono vedere le diverse tendenze tra gruppi e sottogruppi, dopo il trattamento con Arnica montana 6cH (Figura 6). Si noti che gli animali trattati con Arnica e che presentano un edema tardivo (sottogruppo tardivo) sono spostati alla linea di base rispetto agli altri gruppi.
(a)
(b)
(a)
(b)
Il diagramma di dispersione mostra le diverse tendenze dell’evoluzione temporale dell’edema tra i due sottogruppi. I punti bianchi rappresentano il controllo, i punti neri rappresentano Arnica montana 6cH, e i punti grigi rappresentano il desametasone. In ogni grafico, l’asse – mostra l’edema a 30 minuti prima dell’iniezione di carragenina e l’asse – mostra l’edema alla fine dell’esperimento. LATE = tardivo sottogruppo edema; EARLY = precoce sottogruppo edema. Si noti che gli animali che hanno presentato un picco tardivo di edema e sono stati trattati con Arnica montana 6cH sono spostati alla linea di base rispetto agli altri gruppi.
Flowchart delle fasi sperimentali, determinando due sottogruppi di topi secondo la cinetica dell’edema.
4. Discussione
Tra i medicinali omeopatici che hanno particolare interesse nel controllo dell’infiammazione, l’Arnica montana è uno dei più studiati. Tuttavia, nella recente letteratura scientifica sull’omeopatia, ci sono molti studi che cercano di dimostrare l’efficacia del suo effetto, ma pochi lavori sono dedicati alla comprensione dei cambiamenti fisiopatologici nei tessuti dopo l’esposizione degli animali a questi farmaci. È da questo punto di vista che è stato costruito il presente lavoro, attraverso uno studio dettagliato del tessuto connettivo infiammato, considerando i sottoinsiemi di cellule che vi migrano, il comportamento dei vasi e la dinamica dipendente dal tempo di questo processo sotto l’azione di Arnica montana 6cH. È interessante notare che alcuni effetti osservati sono in accordo con i risultati osservati in precedenza, come l’overture dei vasi linfatici e la conseguente riduzione dell’edema.
I primi risultati ottenuti qui puntano verso un fatto interessante: l’analisi individuale di ogni sottogruppo mostra l’importanza della temporalità nell’effetto dell’Arnica montana 6cH; gli animali che presentavano un picco di edema spontaneo tardivo (dopo 30 minuti dall’iniezione irritante) erano più sensibili all’Arnica rispetto agli animali che presentavano un picco di edema iniziale (prima di 30 minuti). In questo caso, l’edema era ancora meno intenso rispetto ai gruppi di controllo e trattati con desametasone, e questo fatto era concomitante con la riduzione significativa della degranulazione dei mastociti e l’aumento del diametro dei vasi linfatici. Entrambi i fenomeni potrebbero contribuire alla riduzione dell’edema macroscopico e differiscono dal modello del desametasone, in cui l’area dei vasi linfatici si riduce passivamente insieme alla riduzione dell’edema, come mostrato nella Figura 2. Questo effetto corrobora i risultati osservati precedentemente in .
Carrageenan è un polisaccaride ottenuto dall’alga Chondrus crispus che ha la capacità di indurre l’infiammazione locale, senza effetti sistemici. È classicamente noto che le prostaglandine sono generate durante la formazione dell’edema dopo l’iniezione sottocutanea di carragenina dai neutrofili migrati. L’osservazione dell’effetto antiedema di Arnica montana 6cH esclusivamente negli animali che presentavano il modello tardivo dell’infiammazione acuta indica la partecipazione di diversi mediatori chimici nelle vie di controllo, come dimostrato in precedenza. In questo senso, l’istamina e la prostaglandina, mediatori il cui picco d’azione si verifica verso i 15-30 minuti, probabilmente modulano questo processo nel sottogruppo dell’edema tardivo, invece di mediatori con un’azione molto precoce, come la bradichinina, il cui picco è circa 10 minuti dopo il rilascio.
Modelli sperimentali progettati appositamente per dimostrare l’importanza della variazione individuale nell’effetto della medicina omeopatica erano già descritti prima, ma mai in un protocollo di infiammazione. Individualità significa specificità nella medicina omeopatica; in Rocha 2008, solo i ratti naturalmente iperattivi erano responsabili del trattamento con Rhus toxicodendron 200cH, per quanto riguarda il loro comportamento in un dispositivo in campo aperto. D’altra parte, Soares 2007 ha osservato che solo i ratti ipoattivi erano responsabili di Bryonia alba 200cH. Questi studi complementari mostrano risultati compatibili con la rispettiva materia medica. Il confronto sistematico di entrambi gli studi e di altri è visto in .
Per quanto riguarda la migrazione cellulare dei sottotipi di leucociti PMN e mononucleati, non si è vista alcuna differenza tra i gruppi e i sottogruppi, né il rapporto CD163+/MAC387+ ha rivelato alcun cambiamento nella dinamica di maturazione dei macrofagi nel sito infiammatorio. Il CD 163 è una glicoproteina transmembrana di tipo I, di 175 kD, nota anche come proteina ED2. La sua presenza è stata descritta nella superficie dei macrofagi maturi, ma anche in modo meno intenso nei monociti immaturi e in altre cellule mononucleate nell’uomo. L’espressione di ED 2 è associata al metabolismo del ferro e aumenta durante le fasi successive dell’infiammazione, perché le cellule positive hanno un ruolo modulatore, rilasciando IL10 autocrina. La presenza di linfociti T e B nel sito infiammatorio potrebbe essere legata ad una certa azione modulatrice, che è stata suggerita in studi precedenti sull’Arnica montana 6cH, ma non confermata qui.
L’espressione delle molecole di adesione CD 54 (ICAM-1) era maggiore negli animali trattati con Arnica montana 6cH che presentavano un modello iniziale di infiammazione ed era associata ad una maggiore percentuale di mastociti degranulati nel tessuto infiammato, ma non ad una maggiore migrazione leucocitaria. Anche se nessuna spiegazione meccanicistica potrebbe essere fatta in questa fase dello studio, sembra che i risultati globali sono divisi in due modelli principali: quelli di regolazione delle dinamiche vascolari, evidente nel sottogruppo edema tardivo, e quelli di regolazione degli eventi cellulari, evidente nel sottogruppo edema precoce, suggerendo una regolazione qualitativa individuale-dipendente degli eventi di infiammazione vascolare e cellulare da Arnica montana 6cH, come visto nella Figura 6. Questi diversi modelli di variabilità, oscillanti secondo lo stato precedente del sistema biologico testato, sono stati descritti sperimentalmente in altri contesti sperimentali con diverse preparazioni omeopatiche .
In conclusione, le due ipotesi proposte potrebbero essere evidenziate: (a) non esiste una modulazione selettiva della migrazione dei sottoinsiemi leucocitari da parte del trattamento con Arnica montana 6cH, ma solo una regolazione vascolare, per quanto riguarda l’assorbimento linfatico, l’espressione del CD54 e la degranulazione dell’istamina e (b) esiste una chiara interferenza della variazione cinetica individuale negli eventi vascolari dopo il trattamento con Arnica montana 6cH.
Conflitto di interessi
Non ci sono conflitti di interessi legati a questo lavoro.
Riconoscimenti
Gli autori ringraziano il programma CAPES-PROSUP e FAPESP Proc. no. 2007/59661-5 per il sostegno finanziario; Marcia Gutierrez di Farmacia Sensitiva per la fornitura di medicinali; Fernanda Ferrari, Paulo Ailton Valdovato, e Lika Osugui per il supporto tecnico.