Fluorescenza

La fluorescenza è una luminescenza che si trova principalmente come fenomeno ottico nei corpi freddi, in cui l’assorbimento molecolare di un fotone ad una certa lunghezza d’onda innesca l’emissione di un altro fotone con una lunghezza d’onda più lunga. La sostanza che diventa fluorescente è chiamata fluoroforo. La differenza di energia tra i fotoni assorbiti e quelli emessi finisce come vibrazioni molecolari o calore. Di solito il fotone assorbito è nella gamma ultravioletta e la luce emessa è nella gamma visibile, ma questo dipende dal fluoroforo usato e da altri fattori.

La fluorescenza prende il nome dal minerale fluorite, composto da fluoruro di calcio, che spesso mostra questo fenomeno. Una varietà di altri minerali e materiali organici sono anch’essi fluorescenti, e sono utilizzati per una serie di applicazioni diverse. Per esempio, la fluorescenza è utile per illuminare e marcare le molecole nella chimica analitica e nella biochimica. I fluorofori sono stati usati per etichettare cellule, anticorpi e altre strutture biologiche, e per determinare le loro strutture e modalità d’azione.

Esempi di materiali fluorescenti

Le pietre preziose, i minerali, le fibre e molti altri materiali che si incontrano nella medicina legale o in relazione a vari oggetti da collezione possono avere una fluorescenza distintiva o possono diventare fluorescenti in modo diverso sotto l’ultravioletto a onde corte, l’ultravioletto a onde lunghe o i raggi X.

Molti tipi di calcite e ambra diventano fluorescenti sotto l’UV a onde corte. Rubini, smeraldi e l’Hope Diamond mostrano una fluorescenza rossa sotto la luce UV a onde corte; i diamanti emettono luce anche sotto i raggi X.

Il petrolio grezzo (petrolio) diventa fluorescente in una gamma di colori, dal marrone opaco per gli oli pesanti e i catrami al bianco giallastro e bluastro per gli oli molto leggeri e i condensati. Questo fenomeno è usato nelle perforazioni per l’esplorazione petrolifera per identificare quantità molto piccole di petrolio nei tagli di perforazione e nei campioni di carote.

I liquidi organici come le miscele di antracene in benzene o toluene, o stilbene negli stessi solventi, diventano fluorescenti con l’irradiazione di raggi ultravioletti o gamma. I tempi di decadimento di questa fluorescenza sono dell’ordine dei nanosecondi poiché la durata della luce dipende dalla durata degli stati eccitati del materiale fluorescente, in questo caso l’antracene o lo stilbene.

Applicazioni

Ci sono molti composti naturali e sintetici che mostrano la fluorescenza, e hanno una serie di applicazioni. Alcuni animali delle profondità marine, come l’occhio nero, usano la fluorescenza.

L’illuminazione

Il comune tubo fluorescente si basa sulla fluorescenza. All’interno del tubo di vetro c’è un vuoto parziale e una piccola quantità di mercurio. Una scarica elettrica nel tubo fa sì che gli atomi di mercurio emettano luce. La luce emessa è nella gamma ultravioletta (UV), è invisibile ed è dannosa per la maggior parte degli organismi viventi. Il tubo è rivestito da un rivestimento di un materiale fluorescente, chiamato fosforo, che assorbe l’ultravioletto e riemette la luce visibile. L’illuminazione fluorescente è molto efficiente dal punto di vista energetico rispetto alla tecnologia a incandescenza, ma gli spettri prodotti possono far apparire alcuni colori innaturali.

A metà degli anni ’90 sono diventati disponibili i diodi a emissione di luce bianca (LED), che funzionano attraverso un processo simile. In genere, il semiconduttore che emette luce produce luce nella parte blu dello spettro, che colpisce un composto di fosforo depositato sul chip; il fosforo diventa fluorescente dalla parte verde a quella rossa dello spettro. La combinazione della luce blu che passa attraverso il fosforo e la luce emessa dal fosforo producono un’emissione netta di luce bianca.

Il moderno lampione a vapore di mercurio si dice sia stato evoluto dalla lampada fluorescente.

I bastoncini luminosi ossidano l’estere di ossalato di fenile per produrre luce.

L’illuminazione fluorescente compatta (CFL) è la stessa di qualsiasi lampada fluorescente tipica con vantaggi. È auto-alimentata e usata per sostituire le incandescenti nella maggior parte delle applicazioni. Producono un quarto del calore per lumen delle lampadine a incandescenza e durano circa cinque volte di più. Queste lampadine contengono mercurio e devono essere maneggiate e smaltite con cura.

Chimica analitica

La fluorescenza in diverse lunghezze d’onda può essere rilevata da un rivelatore ad array, per rilevare i composti dal flusso HPLC. Inoltre, le piastre della cromatografia a strato sottile (TLC) possono essere visualizzate se i composti o un reagente colorante sono fluorescenti.

Le impronte digitali possono essere visualizzate con composti fluorescenti come la ninidrina.

Biochimica e medicina

Le molecole biologiche possono essere marcate con un gruppo chimico fluorescente (fluoroforo) con una semplice reazione chimica, e la fluorescenza del marchio permette una rilevazione sensibile e quantitativa della molecola. Esempi includono:

• La microscopia a fluorescenza di tessuti, cellule o strutture subcellulari è realizzata etichettando un anticorpo con un fluoroforo e permettendo all’anticorpo di trovare il suo antigene target all’interno del campione. L’etichettatura di più anticorpi con fluorofori diversi permette la visualizzazione di obiettivi multipli all’interno di una singola immagine.
• Il sequenziamento automatizzato del DNA con il metodo della terminazione a catena; ciascuna delle quattro diverse basi di terminazione a catena ha il suo tag fluorescente specifico. Quando le molecole di DNA etichettate vengono separate, l’etichetta fluorescente viene eccitata da una sorgente UV, e l’identità della base che termina la molecola viene identificata dalla lunghezza d’onda della luce emessa.
• Rilevamento del DNA: il composto etidio bromuro, quando è libero di cambiare la sua conformazione in soluzione, ha una fluorescenza molto bassa. La fluorescenza dell’etidio bromuro è notevolmente aumentata quando si lega al DNA, quindi questo composto è molto utile per visualizzare la posizione dei frammenti di DNA nell’elettroforesi del gel di agarosio. L’etidio bromuro può essere tossico; un’alternativa più sicura è il colorante SYBR Green.
• Il DNA microarray
• Immunologia: Un anticorpo ha un gruppo chimico fluorescente attaccato, e i siti (per esempio, su un campione microscopico) dove l’anticorpo si è legato possono essere visti, e anche quantificati, dalla fluorescenza.
• FACS (fluorescent-activated cell sorting)
• La fluorescenza è stata usata per studiare la struttura e le conformazioni del DNA e delle proteine con tecniche come il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza, che misura la distanza a livello angstrom. Questo è particolarmente importante nei complessi di biomolecole multiple.
• L’Aequorina, dalla medusa Aequorea victoria, produce un bagliore blu in presenza di ioni Ca2+ (per una reazione chimica). E’ stata usata per visualizzare il flusso di calcio nelle cellule in tempo reale. Il successo con l’aequorina ha stimolato ulteriori indagini su A. victoria e ha portato alla scoperta della proteina fluorescente verde (GFP), che è diventata uno strumento di ricerca estremamente importante. La GFP e le proteine correlate sono utilizzate come reporter per qualsiasi numero di eventi biologici, compresa la localizzazione sub-cellulare. I livelli di espressione genica sono a volte misurati collegando un gene per la produzione di GFP ad un altro gene.

Inoltre, molte molecole biologiche hanno una fluorescenza intrinseca che a volte può essere usata senza la necessità di attaccare un tag chimico. A volte questa fluorescenza intrinseca cambia quando la molecola si trova in un ambiente specifico, quindi la distribuzione o il legame della molecola possono essere misurati. La bilirubina, per esempio, è altamente fluorescente quando è legata a un sito specifico sull’albumina del siero. La protoporfirina di zinco, che si forma nei globuli rossi in via di sviluppo al posto dell’emoglobina quando il ferro non è disponibile o è presente il piombo, ha una fluorescenza brillante e può essere usata per rilevare questi problemi.

A partire dal 2006, il numero di applicazioni della fluorescenza sta crescendo nel settore biologico biomedico e nelle scienze correlate. Anche i metodi di analisi in questi campi stanno crescendo, anche se con una nomenclatura sempre più infelice sotto forma di acronimi come: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. La maggior parte di queste tecniche si basano su microscopi a fluorescenza. Questi microscopi usano fonti di luce ad alta intensità, di solito lampade al mercurio o allo xeno, LED o laser, per eccitare la fluorescenza nei campioni sotto osservazione. I filtri ottici separano poi la luce di eccitazione dalla fluorescenza emessa, per essere rilevata a occhio, o con una telecamera (CCD) o altri rivelatori di luce (tubi fotomoltiplicatori, spettrografi, ecc). Molte ricerche sono in corso per migliorare le capacità di tali microscopi, le sonde fluorescenti utilizzate e le applicazioni a cui sono applicate. Particolarmente degni di nota sono i microscopi confocali, che usano un foro stenopeico per ottenere un sezionamento ottico, offrendo una visione quantitativa e tridimensionale del campione.

Sicurezza

Le lampadine fluorescenti creano molto meno calore residuo delle lampadine a incandescenza e alogene. Le lampadine alogene sono implicate in un gran numero di incendi, e anche le lampadine a incandescenza comportano un maggior rischio di incendio rispetto alle lampadine fluorescenti, a causa del calore disperso. Le lampade possono cadere accidentalmente, o a volte da eventi come i terremoti. L’uso di lampadine fluorescenti può quindi essere un mezzo per prevenire incendi accidentali. Tuttavia, le lampadine fluorescenti possono contenere mercurio, e la rottura di una tale lampadina potrebbe provocare una costosa fuoriuscita di mercurio.

Considerazioni teoriche

Fotochimica

La fluorescenza si verifica quando una molecola o un punto quantico si rilassa al suo stato fondamentale dopo essere stato eccitato elettronicamente.

Eccitazione: S 0 + h ν → S 1 {displaystyle S_{0}+h\nu \a S_{1}}

Fluorescenza (emissione): S 1 → S 0 + h ν {displaystyle S_{1} a S_{0}+h\nu } , qui h ν {displaystyle h\nu } è un termine generico per l’energia dei fotoni dove: h = costante di Planck e ν {displaystyle \nu } = frequenza della luce. (Le frequenze specifiche della luce eccitante ed emessa dipendono dal particolare sistema.)

Lo stato S0 è chiamato lo stato base del fluoroforo (molecola fluorescente) e S1 è il suo primo stato eccitato (elettronicamente).

Una molecola nel suo stato eccitato, S1, può rilassarsi attraverso vari percorsi concorrenti. Può subire un “rilassamento non radiativo” in cui l’energia di eccitazione viene dissipata come calore (vibrazioni) al solvente. Le molecole organiche eccitate possono anche rilassarsi attraverso la conversione in uno stato di tripletto che può successivamente rilassarsi attraverso la fosforescenza o attraverso una fase secondaria di rilassamento non radiativo.

La distensione di uno stato S1 può avvenire anche attraverso l’interazione con una seconda molecola attraverso il quenching della fluorescenza. L’ossigeno molecolare (O2) è un quencher estremamente efficiente della fluorescenza a causa del suo insolito stato triplete di terra.

Le molecole che sono eccitate attraverso l’assorbimento della luce o attraverso un processo diverso (ad esempio come prodotto di una reazione) possono trasferire energia a una seconda molecola ‘sensibilizzata’, che viene convertita nel suo stato eccitato e può quindi diventare fluorescente. Questo processo è usato nei lightsticks.

Rendimento quantico di fluorescenza

Il rendimento quantico di fluorescenza dà l’efficienza del processo di fluorescenza. E’ definito come il rapporto tra il numero di fotoni emessi e il numero di fotoni assorbiti.

Φ = # p h o t o n s e m i t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {displaystyle \Phi ={frac {rm {## fotoni emessi}}{rm {# fotoni assorbiti}}}}

Il massimo rendimento quantico di fluorescenza è 1,0 (100%); ogni fotone assorbito risulta in un fotone emesso. Composti con rendimenti quantici di 0,10 sono ancora considerati abbastanza fluorescenti. Un altro modo per definire la resa quantica della fluorescenza, è attraverso i tassi di decadimento dello stato eccitato:

k f ∑ i k i {displaystyle {\frac {{k}_{f}}{sum _{i}{k}_{i}}}}

dove k f {displaystyle {k}_{f} è il tasso di emissione spontanea di radiazione e

∑ i k i {displaystyle \sum _{i}{k}_{i}

è la somma di tutti i tassi di decadimento dello stato eccitato. Altri tassi di decadimento dello stato eccitato sono causati da meccanismi diversi dall’emissione di fotoni e sono quindi spesso chiamati “tassi non radiativi”, che possono includere: quenching collisionale dinamico, interazione dipolo-dipolo in campo vicino (o trasferimento di energia di risonanza), conversione interna e attraversamento intersistemico. Quindi, se il tasso di qualsiasi percorso cambia, questo influenzerà sia il tempo di vita dello stato eccitato che la resa quantica di fluorescenza.

La resa quantica di fluorescenza viene misurata per confronto con uno standard con quantologia nota; il sale di chinina, il solfato di chinina, in una soluzione di acido solforico è uno standard di fluorescenza comune.

Vita di fluorescenza

La vita di fluorescenza si riferisce al tempo medio in cui la molecola rimane nel suo stato eccitato prima di emettere un fotone. La fluorescenza segue tipicamente una cinetica di primo ordine:

= 0 e – Γ t , {displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

dove {displaystyle \left} è la concentrazione di molecole dello stato eccitato al tempo t {displaystyle t} , 0 {displaystyle \left_{0}} è la concentrazione iniziale e Γ {displaystyle \Gamma } è il tasso di decadimento o l’inverso del tempo di vita della fluorescenza. Questo è un esempio di decadimento esponenziale. Vari processi radiativi e non radiativi possono de-popolare lo stato estratto. In tal caso il tasso di decadimento totale è la somma di tutti i tassi:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

dove Γ t o t {displaystyle \Gamma _{tot} è la velocità di decadimento totale, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} il tasso di decadimento radiativo e Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} il tasso di decadimento non radiativo. È simile a una reazione chimica del primo ordine in cui la costante di velocità del primo ordine è la somma di tutte le velocità (un modello cinetico parallelo). Se il tasso di emissione spontanea, o uno qualsiasi degli altri tassi sono veloci, il tempo di vita è breve. Per i composti fluorescenti comunemente usati, i tipici tempi di decadimento dello stato eccitato per i composti fluorescenti che emettono fotoni con energie dall’UV al vicino infrarosso sono compresi tra 0,5 e 20 nanosecondi. Il tempo di vita della fluorescenza è un parametro importante per le applicazioni pratiche della fluorescenza come il trasferimento di energia di risonanza della fluorescenza.

Regole

Ci sono diverse regole che riguardano la fluorescenza. La regola di Kasha-Vavilov detta che la resa quantica della luminescenza è indipendente dalla lunghezza d’onda della radiazione eccitante.

Questa regola non è sempre valida e viene violata gravemente in molte molecole semplici. Un’affermazione un po’ più affidabile, anche se ancora con eccezioni, è che lo spettro di fluorescenza mostra una dipendenza molto piccola dalla lunghezza d’onda della radiazione eccitante.

Vedi anche

• Fluoresceina
• Lampada fluorescente
• Luce
• Fosforescenza
• Raggi X

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principi di spettroscopia di fluorescenza, 3a ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Moderna fotochimica molecolare. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Fluorescenza molecolare: Principi e applicazioni. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

Tutti i link recuperati il 14 aprile 2017.

• Fluorofori.org Il database dei coloranti fluorescenti
• Fluorescenza su Scienceworld
• Concetti di base sulla fluorescenza