- Osservazione di embrioni fecondati a embrioni di clivaggio
- Figura 1.
- Figura 2.
- Figura 3.
- 2.1. Morfocinetica della scissione embrionale basata sull’imaging time-lapse
- 2.2. Espressione genica dell’embrione di clivaggio e valutazione non invasiva della vitalità dell’embrione attraverso l’analisi dei mezzi di coltura
Osservazione di embrioni fecondati a embrioni di clivaggio
Da quando la prima coltura di embrioni di coniglio fu descritta nel 1912 e gli zigoti di topo potevano essere coltivati in vitro per formare embrioni allo stadio di blastocisti, la qualità dell’embrione è diventata un fattore importante per la gravidanza dopo il trasferimento dell’embrione in vitro nell’utero perché la qualità dell’embrione ha una stretta correlazione con l’impianto dell’embrione trasferito nell’utero. Dalla nascita del primo bambino “in provetta”, Louise Brown nel luglio 1978, per il quale il premio Nobel 2010 per la fisiologia o la medicina è stato assegnato a Robert Edwards per aver sviluppato la fecondazione in vitro (IVF) e il trasferimento di embrioni (ET) per trattare l’infertilità nelle donne con ovidotti non brevettati, la produzione di embrioni in vitro (IVP) è stata ampiamente utilizzata nel trattamento dell’infertilità umana e nella riproduzione ed espansione della popolazione animale. Tuttavia, il successo della tecnologia riproduttiva assistita dipende principalmente dalla produzione di embrioni vitali con un alto potenziale di impianto. Ancora più importante, la scelta del miglior embrione per il trasferimento è diventata la sfida principale nella FIVET. Nelle prime colture embrionali, la valutazione della qualità embrionale si basava principalmente sui criteri morfologici dell’embrione trasferito. Così, l’esecuzione di un’osservazione seriale della morfologia embrionale è una tecnica comune per gli embriologi per valutare gli embrioni ed è stata considerata come un predittore chiave dell’impianto e della gravidanza. Per un lungo periodo, gli embriologi hanno eseguito valutazioni della qualità e della morfologia degli embrioni prendendo gli embrioni dall’incubatrice e mettendoli sotto un microscopio. Oltre all’osservazione della morfologia, i ricercatori sono interessati a una serie di studi sul cambiamento nucleare delle cellule, l’attivazione e l’espressione dei geni, l’espressione delle proteine citoplasmatiche, la differenziazione dei blastomeri, e così via. Tuttavia, questi studi spesso portano alla morte degli embrioni. Per esempio, nel nostro studio iniziale che osservava il cambiamento del microfuso dopo l’ingresso dello sperma nell’uovo o l’attivazione dell’ovocita, gli zigoti fecondati o le uova attivate dovevano essere fissati sul vetrino e colorati con fluoresceina immunocitochimica e microscopia confocale laser. La nostra ricerca ha mostrato chiaramente l’alterazione del microtubulo e della cromatina dopo l’attivazione dell’ovocita bovino e l’iniezione introcitoplasmatica dello sperma (ICSI; Figura 1). Lo sperma nell’ovocita o il calcio ionophore e l’etanolo possono attivare l’ovocita e causare l’estrusione del secondo corpo polare. Per osservare il tempo del secondo corpo polare, abbiamo colorato varie fasi degli ovociti dopo l’attivazione. Il risultato ha mostrato che dopo 5 ore di post-attivazione, il secondo corpo polare può essere completamente estruso (Figura 2).
Figura 1.
Microscopia confocale a scansione laser dei cambiamenti del fuso e della cromatina nei vari tempi post-attivazione e iniezione intracitoplasmatica dello sperma (ICSI) nel bovino. Lettere maiuscole (a sinistra) indicano il cambiamento post-attivazione e piccole lettere (a destra) indicano dopo ICSI. A/a ha mostrato a 0,5 h, B/b è 2 h, C/c è 3 h, e D/d è 7 h post-attivazione o ICSI. Prenucleo nell’uovo attivato e prenuclei in uovo ICSI sono apparsi con colore rosso.
Figura 2.
Microscopia confocale a scansione laser del fuso e cambiamenti cromatina ai vari tempi post attivazione nel bovino. A 0,5 ore dopo l’attivazione, i cromosomi del fuso iniziano a dividersi, e il completamento della divisione del fuso richiede circa 3 ore e il secondo corpo polare può essere estruso a circa 5 ore. Il rosso e il verde insieme indicano il fuso, e il punto rosso indica il primo corpo polare.
Lo studio dell’espressione genica richiede spesso di isolare mRNA o proteine dagli embrioni; quindi, gli embrioni dovevano essere lisati e nessun embrione sarebbe sopravvissuto. Per studiare la differenziazione cellulare sugli embrioni allo stadio di blastocisti e morale, è stato utilizzato un metodo di doppia colorazione con microscopia a fluoresceina per distinguere la massa cellulare interna (ICM) dal trofoectoderma (TE). I numeri di due diverse cellule possono essere contati sulla base di colori diversi (ICM come blu e TE come rosa, Figura 3).
Figura 3.
Distinguere diverse cellule in embrioni bovini blastocisti con doppia colorazione. La figura in alto mostra un embrione di blastocisti con massa cellulare interna marcata (ICM) e intorno alle cellule del tropoctoderma (TE). La figura in basso mostra un embrione di blastocisti bovina con doppia colorazione: blu come ICM e rosa come cellule TE. L’immagine in alto è da una ricerca su una pagina web, e l’autore apprezza molto la cortesia del Prof. Fuliang Du per la foto inferiore inedita.
Questi metodi di ricerca alla fine danneggiano tutti gli embrioni, ed è impossibile applicare questi metodi alla pratica clinica. Pertanto, l’attuale valutazione della qualità embrionale si basa principalmente sui criteri morfologici degli embrioni trasferiti, che comprende tre parametri principali come la regolarità dei blastomeri, la frammentazione e la granularità citoplasmatica. Inoltre, il numero di cellule embrionali in diversi giorni di coltura e la multinuclearità possono essere considerati per valutare la qualità dell’embrione. Diversi rapporti hanno documentato l’associazione tra le caratteristiche morfologiche degli embrioni in fase di clivaggio con il successo della gravidanza. Pertanto, questo è attualmente il metodo di base per la valutazione della qualità embrionale nella FIVET umana e nella produzione di embrioni in vitro su animali. Tuttavia, anche se questo è facilmente praticabile, porta spesso gli embrioni fuori dall’incubatrice, il che porta a preoccupazioni per la sicurezza e la stabilità delle condizioni di coltura. Inoltre, alcuni punti chiave dello sviluppo embrionale possono essere persi durante l’osservazione. La valutazione degli embrioni di clivaggio durante la coltura e prima del trasferimento embrionale è una pratica clinica importante. Attualmente, la principale valutazione degli embrioni fecondati in vitro è l’osservazione visiva tramite microscopia. Negli ultimi anni, vari incubatori di microscopia time-lapse vengono utilizzati nella clinica della FIVET umana per monitorare tutte le fasi della crescita e dello sviluppo embrionale. Anche se le tecnologie di diagnosi embrionale preimpianto e di screening (PGD/PGS) sono state applicate nella pratica della selezione embrionale umana per migliorare il tasso di gravidanza, queste tecniche sono invasive per gli embrioni. Trovare un altro metodo non invasivo per selezionare un buon embrione sarà molto utile nella pratica ART umana. Sallam et al. hanno passato in rassegna i metodi non invasivi per la selezione degli embrioni e li hanno valutati alla luce delle migliori prove attualmente disponibili per scoprire se qualcuno di loro è maturo per sostituire o integrare il metodo di valutazione morfologica. Quindi, abbiamo bisogno di strumenti più potenti per stimare i marcatori morfocinetici degli embrioni.
2.1. Morfocinetica della scissione embrionale basata sull’imaging time-lapse
Per decenni, i ricercatori hanno cercato di seguire lo sviluppo degli organismi multicellulari dalle uova fecondate agli adulti. Mentre gli scienziati avevano esplorato le singole fasi di questo processo, non esisteva alcun metodo che permettesse loro di modellare dal vivo l’intero processo di sviluppo. Attualmente, i progressi nella microscopia light-sheet riportati in due Nature Methodspapers hanno permesso ai ricercatori di visualizzare lo sviluppo iniziale in grande dettaglio. I recenti microscopi light-sheet utilizzano un foglio di luce laser per illuminare una sezione sottile di un campione e catturare l’intero piano in un’istantanea. Questo permette loro di utilizzare molta meno luce rispetto ai microscopi confocali o a due fotoni. È molto veloce, ma anche molto delicato per eseguire estremamente bene in più modi critici allo stesso tempo . Per l’imaging dello sviluppo di interi embrioni come quelli di Drosophila, zebrafish e topi, questa nuova tecnica di imaging multiview è fantastica.
Il time-lapse imaging è un’altra tecnologia emergente e non invasiva che permette il monitoraggio 24 ore su 24 dello sviluppo embrionale, offrendo la possibilità di aumentare la quantità e la qualità delle informazioni morfologiche senza disturbare le condizioni di coltura. Il microscopio time-lapse è molto utile per l’osservazione dello sviluppo embrionale. Nell’ultimo decennio, molte cliniche o centri di fecondazione assistita umana hanno iniziato a utilizzare l’imaging time-lapse per monitorare la crescita e la divisione embrionale durante la cultura in vitro e infine per selezionare l’embrione di buona qualità per il trasferimento in base ai dati registrati e alle immagini. Questa tecnica è stata segnalata per essere in grado di migliorare l’impianto dell’embrione trasferito e la gravidanza. Sulla base della registrazione time-lapse per la scissione dell’embrione, si può determinare la velocità normale di scissione dell’embrione. Così, nel secondo capitolo di questo libro, la tempistica della scissione embrionale è stata delineata sulla base di marcatori morfocinetici dal monitor time-lapse. Secondo questo schema dei tempi di scissione embrionale, gli embriologi possono sapere chiaramente in quale fase un embrione dovrebbe essere in vari punti temporali. Così, un embrione di qualità ottimale o un embrione ad alto potenziale di impianto può essere selezionato per il trasferimento per ottenere un tasso di gravidanza più elevato. Utilizzando il sistema di registrazione continua e frequente, alcuni marcatori morfocinetici possono essere rivelati nel sistema time-lapse. Per esempio, la rapida divisione delle cellule embrionali in un dato momento spesso si traduce in un tasso di impianto inferiore. Nella situazione normale, la divisione da zigote in 2-3 cellule richiede circa 10-11 ore di tempo, ma Rubio et al. hanno trovato che alcuni embrioni spendono solo circa 5 ore per completare questa divisione, e questi embrioni hanno un tasso di impianto molto più basso rispetto agli embrioni di divisione normale (1,2% vs 20%). Inoltre, la scissione ineguale dell’embrione che è definita come un’abruzione di un blastomero in tre blastomeri figlia o un intervallo di ciclo cellulare inferiore a 5 ore spesso produce un potenziale di impianto significativamente inferiore. Quindi, possiamo usare questi marcatori morfocinetici più precisi per distinguere la qualità dell’embrione.
Il terzo capitolo esamina e verifica ulteriormente se la tecnologia di imaging time-lapse è utile per la selezione di embrioni “di alta qualità” per il trasferimento per migliorare il risultato ART piuttosto che la valutazione morfologica convenzionale. È interessante notare che le possibili correlazioni tra il sesso dell’embrione, la frammentazione dell’embrione, i protocolli di trattamento, i diversi mezzi di coltura e la morfocinetica dell’embrione sono stati valutati sulla base di alcune nuove ricerche sugli impianti di imaging time-lapse. Inoltre, vengono discussi anche vari algoritmi e modelli predittivi progettati nei cicli ART con imaging time-lapse. Per esempio, molte ricerche sulla velocità di sviluppo embrionale animale e umano attraverso l’osservazione della morfologia ordinaria hanno mostrato che gli embrioni maschi crescono più velocemente degli embrioni femmine. Tuttavia, l’attuale osservazione del time-lapse imaging può fornire informazioni più dettagliate ed esatte sulla differenza negli embrioni maschili e femminili durante le prime divisioni. Anche se gli embrioni femminili hanno mostrato la scissione tardiva (t8), la morula (tM) e i parametri morfocinetici dello stadio di blastocisti, hanno presentato un’espansione anticipata rispetto ai maschi. Così, i punti chiave del tempo di osservazione è legato allo sviluppo del genere embrionale. È interessante notare che gli autori hanno progettato un modello in base al tempo della seconda sincronia e della formazione della morula con quattro sottogruppi per prevedere la probabilità che un embrione sia femmina.
Al fine di studiare ulteriormente ed esplorare la morfocinetica della scissione embrionale, il quarto capitolo discute alcuni metodi per l’analisi spazio-temporale della scissione embrionale in vitro.L’analisi automatizzata o semiautomatizzata del time-lapse delle immagini dell’embrione durante la fase di scissione può dare un’idea dei tempi della mitosi, della regolarità dei tempi e del modello di divisione, così come del lignaggio delle cellule. Il monitoraggio simultaneo dei processi molecolari permette lo studio delle connessioni tra l’espressione genetica e la fisiologia cellulare e lo sviluppo. Con i dati di imaging time-lapse e il software analitico, si può facilmente creare un sequenziamento video quadridimensionale degli embrioni, in modo che gli embrioni in crescita mostrino nuove intuizioni sullo sviluppo embrionale temporale. In questo capitolo, gli autori descrivono tre metodi con variazioni nell’analisi dell’hardware e del software dando alcuni esempi dei risultati per aprire una finestra a nuove informazioni nell’embriologia dello sviluppo, come il modello di divisione embrionale e il lineage sono studiati in vivo.
2.2. Espressione genica dell’embrione di clivaggio e valutazione non invasiva della vitalità dell’embrione attraverso l’analisi dei mezzi di coltura
Lo sviluppo dell’embrione preimpianto sperimenta una serie di eventi critici e notevoli modifiche epigenetiche, e la riprogrammazione dell’espressione genica avviene per attivare il genoma embrionale. Nelle prime fasi dello sviluppo embrionale preimpianto, gli mRNA materni dirigono lo sviluppo embrionale. Durante tutto lo sviluppo embrionale precoce, un modello di metilazione differenziale è mantenuto, anche se alcuni mostrano cambiamenti fase-specifici. Studi recenti hanno dimostrato che il processo di demetilazione differenziale si traduce in un’espressione genica parentale differenziale nei primi embrioni in via di sviluppo che può avere un impatto sullo sviluppo corretto. Inoltre, gli RNA non codificanti, gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA), e gli RNA corti non codificanti, i microRNA (miRNA) hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella regolazione degli mRNA, e quindi il loro ruolo nello sviluppo preimpianto ha acquisito importanza. Il quinto capitolo passa in rassegna i diversi fattori che influenzano l’espressione genica durante lo sviluppo dell’embrione preimpianto, che include i fattori epigenetici, concentrandosi sui profili di metilazione, dei gameti e degli embrioni preimpianto. Gli effetti degli RNA non codificanti sull’espressione genica sono stati valutati a fondo.
Perché l’espressione genica appare durante lo sviluppo embrionale in coltura in vitro, gli embrioni preimpianto richiedono spesso mezzi di coltura ricchi di nutrimento. L’embrione durante la sua crescita e lo sviluppo ha bisogno di assorbire alcuni importanti componenti nutritivi dal mezzo di coltura e produrre metabolicamente alcuni sottoprodotti come risultati di espressione genica. Da questo punto di vista, la coltura in vitro degli embrioni fornisce anche un materiale molto importante per un’ulteriore valutazione non invasiva dell’embrione per mezzo dell’esame dei biomarcatori nel mezzo di coltura embrionale usato. I metodi attualmente sviluppati si concentrano sulla misurazione dei composti metabolici secreti dagli embrioni in via di sviluppo. Questi studi utilizzano principalmente gli strumenti della moderna analitica e della proteomica. Alcuni studi suggeriscono che la profilazione metabolica dei mezzi di coltura embrionale utilizzando spettroscopie ottiche e non ottiche può fornire un utile complemento alle attuali strategie di valutazione degli embrioni e fornire informazioni sul fenotipo degli embrioni con un potenziale riproduttivo crescente.
Nel sesto capitolo, gli autori descrivono la loro nuova scoperta, la catena alfa-1 della molecola di aptoglobina umana come biomarcatore quantitativo della vitalità embrionale. In una serie di esperimenti retrospettivi e ciechi hanno raggiunto un tasso di successo superiore al 50%. Questo capitolo riassume gli approcci metabolici e proteomici attualmente disponibili come valutazione molecolare non invasiva della vitalità embrionale. Studi recenti hanno dimostrato che la valutazione dei componenti molecolari dei mezzi di coltura è un’area promettente nella ricerca dei marcatori di successo dell’impianto embrionale con il successivo sviluppo di una gravidanza clinica e la nascita di un bambino sano per migliorare l’efficienza del trattamento con tecniche ART. Se la composizione molecolare dei mezzi di coltura può essere utilizzata come una procedura aggiuntiva non invasiva per scegliere un embrione per il trasferimento selettivo, sarà molto utile per migliorare l’esito della gravidanza umana IVF.