Analisi neurogenetica del disturbo disintegrativo infantile

Soggetti dello studio

Le caratteristiche cliniche della coorte CDD e il numero di soggetti esaminati per ogni modalità di studio sono indicati nella tabella 1. Il rapporto tra i sessi di 3,25 maschi e 1 femmina è simile a quello riportato per l’ASD. L’età media e mediana all’insorgenza dei sintomi era 46 e 40 mesi, rispettivamente, con un range di 28 a 84 mesi. Il settanta per cento dei soggetti ha sperimentato un prodromo di ansia e terrore. Il trenta per cento dei soggetti ha avuto episodi multipli di regressione. La durata del primo episodio regressivo variava da 2 mesi a quasi 7 anni in un soggetto. La maggior parte dei soggetti ha un ID da grave a profondo, con un QI medio e mediano di 30 e 26, rispettivamente, con un range da 8 a 74. Tutti avevano perdita di abilità linguistiche, perdita di abilità sociali o comportamento adattivo, e perdita di abilità di gioco. Il 65% ha perso il controllo dell’intestino o della vescica, e la stessa percentuale ha perso le capacità motorie. Anche se CDD è stato segnalato per essere quasi sempre sporadico, alcuni dei nostri soggetti hanno membri della famiglia immediata con ASD o caratteristiche autistiche, tra cui due serie di gemelli monozigoti. Entrambi i membri di una coppia (CDD13-03/04) hanno CDD; nell’altra coppia (CDD20-03/04), uno ha CDD e l’altro ha ASD.

Genetica

Data la rarità, la gravità e la trasmissione apparentemente sporadica vista nella maggior parte dei casi CDD, abbiamo ipotizzato che le varianti rare di grande effetto contribuiscono all’eziologia. Infatti, ci sono prove abbondanti per il contributo di varianti rare a ASD. Come mostrato nella Tabella 2, abbiamo trovato una o più varianti rare per tutti i probandi tranne uno, che non erano condivise da nessun controllo dei fratelli non affetti (file aggiuntivo 2: Tabella S2). Abbiamo anche cercato varianti eterozigote composte nei soggetti cercando ulteriori varianti nei geni interessati da varianti de novo, ma non ne abbiamo trovate. I tassi di tutte le varianti de novo ad alta probabilità (punteggio di qualità bayesiano ≥ 50) erano 0.80/proband exome e 0.92/sibling exome (Additional file 2: Tabella S3), che sono simili ai tassi complessivi calcolati da 11 recenti studi WES di disturbi del neurosviluppo: 1.00/proband exome, n = 2358; 0.82/control exome, n = 731 . Non c’erano differenze significative nei tassi di varianti non-sinonime de novo, omozigote e emizigote (file aggiuntivo 2: tabella S3); il tasso di geni espressi nel cervello interessati; filogenetico P value (PhyloP) punteggi di conservazione a posizioni di varianti; Residual Variation Intolerance Scores (RVIS); e polimorfismo fenotipizzazione v2 (PolyPhen-2) punteggi (file aggiuntivo 2: tabella S2) tra i probandi e fratelli.

Abbiamo trovato una CNV genica de novo in un probando (0,07/banda, Tabella 2), che è simile ai tassi precedentemente riportati per ASD, e nessuna nei fratelli. Il CNV del probando è una delezione eterozigote di 2 kb del 3′UTR di OGDHL, che codifica un componente di un complesso proteico mitocondriale implicato nella neurodegenerazione. Un gene, SUPT20HL2, e due famiglie di geni, USP e BBS, sono interessati in più di un probando CDD. Due varianti missense emizigote sono state identificate in SUPT20HL2, che codifica un fattore di trascrizione putativo ma potrebbe essere uno pseudogene secondo il database UniProtKB (http://www.uniprot.org/). Tre membri della famiglia dei geni USP (ubiquitin-specific peptidase) sono interessati nei probandi CDD: USP9X (missenso emizigote), USP9Y (non-senso ereditato paternamente) e USP26 (missenso emizigote). Essi codificano gli enzimi deubiquitinanti che impediscono la degradazione delle proteine. Due membri della famiglia del gene della sindrome di Bardet-Biedel (BBS), che è coinvolto nella ciliogenesi, hanno varianti missense de novo nei probandi CDD: BBS5 e BBS9. Anche se le varianti specifiche che cambiano le proteine identificate nei soggetti CDD erano rare e non precedentemente associate alla malattia, abbiamo esaminato la letteratura e trovato alcune sovrapposizioni tra i geni candidati CDD e i geni potenzialmente associati ad altri disturbi neurologici (Tabella 2).

Non c’erano varianti chiaramente deleterie nei probandi CDD. Per identificare le varianti potenzialmente patogene, abbiamo considerato una combinazione di fattori: (1) espressione cerebrale positiva, (2) punteggio PhyloP ≥ 1.30 (P = 0.05 per la conservazione), (3) RVIS negativo (gene intollerante alla variazione), e (4) classificazione PolyPhen-2 di missenso probabilmente dannoso (o n/a dovuto a una variante diversa dal missenso). Dei 47 geni candidati alla CDD, 14 hanno soddisfatto tutti questi criteri: NRK, TBC1D8B, TRRAP, NAV2, OGDHL, ZNF236, PRKCSH, MTMR8, BCOR, SRPK3, USP9Y, KIAA2018, CXorf57, e ALG13 (Tabella 2). Per affinare ulteriormente questo elenco, l’ispezione dei dati di sequenziamento dal Exome Aggregation Consortium (http://exac.broadinstitute.org/) ha rivelato che: (1) le varianti in tutti i geni tranne NAV2, MTMR8 e ALG13 sono nuove o trovate al massimo una volta nel dataset e (2) tra i restanti 11 geni, 4 sono tra il 5% più intolleranti: TRRAP, ZNF236, BCOR e KIAA2018.

TRRAP (transformation/transcription domain-associated protein)affetta da una variante missense de novo in un maschio CDD proband; codifica un componente dei complessi istone acetiltransferasi ed è coinvolto nella trascrizione e riparazione del DNA. Non è associato a un disturbo OMIM, ma varianti de novo sono state identificate in altri disturbi neurologici (Tabella 2). Anche ZNF236 (Zinc Finger Protein 236) è affetto da una variante missense de novo in un probando maschio; potrebbe essere coinvolto nella regolazione trascrizionale (UniProtKB) ma non è associato a un disturbo noto. BCOR (BCL6 Corepressor) è affetto da una variante missense emizigote in un probando maschio CDD; codifica un corepressore trascrizionale. È associato con microftalmia sindromica, che può avere la caratteristica di ID ma altrimenti non caratterizza il probando CDD e di solito è causato da mutazioni troncanti nelle femmine. KIAA2018 è affetto da una delezione omozigote di un aminoacido in un probando maschio CDD; è anche conosciuto come USF3 (fattore di trascrizione a monte 3). Non è associato a un disturbo OMIM, ma varianti de novo sono state identificate in altri disturbi neurologici (Tabella 2). Da notare, tutti questi geni candidati top o svolgono un ruolo o possono essere coinvolti nella trascrizione, che caratterizza molti geni associati ASD pure.

Utilizzando il set di dati umano BrainSpan exon-array trascrittoma, abbiamo tracciato il livello di espressione mediana dei geni candidati CDD come un gruppo per tutte le regioni del cervello disponibili da embrionale alle fasi di tarda età adulta (n = 40 geni rappresentati una volta nel core probe set, Additional file 2: Tabella S4). Come mostrato dal profilo di espressione in Fig. 1, i geni candidati CDD sono più altamente espressi nelle regioni non-neocorticali rispetto alle regioni neocorticali attraverso la durata della vita (Additional file 2: Tabella S5). Inoltre, ci sono livelli crescenti di espressione nella AMY, STR, e HIP durante i periodi 10 (1-6 anni) e 11 (6-12 anni), l’intervallo che comprende l’età di insorgenza dei sintomi nella nostra coorte CDD.

Alla luce di questa osservazione, abbiamo confrontato la differenza nei livelli di espressione mediana tra le regioni non-neocorticali e neocorticali per i geni interessati da varianti non-sinonime e sinonime in probandi CDD, i loro fratelli non affetti e i probandi ASD della Simons Simplex Collection (SSC) con e senza regressione abbinati per sesso, età alla valutazione, QI e gravità dei sintomi dell’autismo (vedi file aggiuntivo 1: Informazioni supplementari per i dettagli di selezione della coorte). Il profilo di espressione dei geni candidati CDD è qualitativamente distinto dagli altri insiemi di geni, tranne che è simile al profilo dei geni colpiti da varianti non sinonime in probandi SSC con regressione, anche se hanno solo un gene, NAV2, in comune (Fig. 2, file aggiuntivo 2: Tabelle S4 e S6). La differenza di espressione, non-neocorticale meno neocorticale, raggiunge un valore massimo positivo a metà feto. Per i geni candidati CDD, questo si verifica al periodo sei; test di permutazione con 100.000 iterazioni di 40 geni selezionati a caso dal set di dati BrainSpan confermato la significatività di questa espressione differenziale (P = 0.0022). Abbiamo esteso l’analisi a diversi altri insiemi di geni, come quelli identificati in probandi SSC e fratelli non affetti con varianti non sinonimi, sinonimi e LGD; geni più significativamente associati con ASD da tre recenti grandi studi WES e CNV; e tutti i geni nel set di dati BrainSpan. Il profilo di espressione dei geni colpiti da varianti non sinonime nei probandi CDD e SSC con regressione è qualitativamente distinto da questi altri insiemi pure (file aggiuntivo 1: Figura S1, file aggiuntivo 2: Tabelle S4 e S6).

Abbiamo anche studiato se i geni candidati CDD sono coespressi tra loro. Dei 40 geni candidati, 11 sono coespressi con almeno un altro gene candidato in tutte le regioni del cervello e periodi di tempo con un coefficiente di correlazione di Pearson r ≥ 0,7 (Fig. 3, Additional file 2: Tabella S7). Ci sono 23 tali connessioni, per una media di 2.09 correlazioni/gene e un coefficiente medio di 0.779. Test di permutazione con 100,000 iterazioni di 40 geni selezionati a caso dal set di dati BrainSpan ha rivelato che osservando 11 geni con almeno 2.09 correlazioni / gene è significativo (P = 0.036), come è osservando 11 geni con un coefficiente di correlazione media di almeno 0.779 (P = 0.019). Soddisfare entrambe le soglie è anche significativo (P = 0.0059). Dal momento che tutti i 11 geni candidati CDD che sono coespressi con l’altro hanno espressione cerebrale positiva come per il set di dati BrainSpan, test di permutazione con 100.000 iterazioni è stato anche eseguito con 40 geni selezionati a caso cervello-espresso da BrainSpan. Mentre osservando 11 geni con almeno 2.09 correlazioni/gene non è significativo (P = 0.066), osservando 11 geni con un coefficiente di correlazione medio di almeno 0.779 è significativo (P = 0.022) come è incontrare entrambe le soglie (P = 0.011). Confrontando l’insieme di 11 geni candidati CDD coespressi con il restante set di 29 che non sono coespressi non ha rivelato differenze significative tra il tasso di geni espressi nel cervello, punteggi PhyloP o punteggi PolyPhen-2; tuttavia, i geni coespressi sono significativamente più intollerante di variazione (media RVIS -1.42 contro -0.15, t(35) = -2.91, P = 0.0062, test t indipendente, a due code). Gene ontology analisi di arricchimento utilizzando il Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery v6.8 (https://david.ncifcrf.gov/) per l’intero set di geni candidati CDD, e il sottoinsieme di 11 geni coespressi non ha identificato l’arricchimento significativo di termini GO dopo Benjamini-Hochberg correzione dei valori P.

Sistemi neurali

Data l’universalità dei deficit sociali nell’ASD, la disfunzione nei sistemi cerebrali che servono la percezione sociale, compresa la percezione dei volti, è un obiettivo chiave della ricerca ASD. Gli stimoli visivi dei volti e delle case attivano e dissociano in modo affidabile i sistemi coinvolti nell’elaborazione delle informazioni socioemotive (volti paurosi) e non socioemotive (case). Abbiamo studiato quattro coorti: CDD (n = 7), LFASD (n = 7), HFASD (n = 14), e TD (n = 19). Anche se gli individui con LFASD sono più numerosi di quelli con CDD, il nostro campione era ancora limitato dalla difficoltà di ottenere dati di neuroimaging di alta qualità (e eye-tracking) in soggetti a basso funzionamento. Detto questo, a nostra conoscenza, questa è la prima presentazione in assoluto di dati fMRI non sedati da individui con ASD e ID marcato.

Non ci sono state differenze significative nel sesso, età, volume intracranico e movimento della testa nello scanner tra le quattro coorti. I gruppi CDD e LFASD non erano anche significativamente diversi per IQ e gravità dell’autismo, e i gruppi HFASD e TD non erano significativamente diversi per IQ (file aggiuntivo 2: tabelle S8 e S9). In primo luogo, abbiamo utilizzato un campione di scoperta di 12 dei nostri 19 soggetti TD in un’analisi whole-brain per una localizzazione indipendente delle regioni di interesse coinvolte nell’elaborazione dei volti rispetto alle case. La figura 4a illustra le regioni della corteccia occipitotemporale ventrolaterale in cui i soggetti TD hanno mostrato una significativa attivazione delle facce > case (Additional file 2: tabella S10). Queste regioni comprendevano le posizioni attese di nodi ben noti della rete occipitotemporale faccia-sensibile tra cui l’area viso fusiforme e l’area viso occipitale. Come mostrato in Fig. 4b e file aggiuntivo 2: Tabella S11, l’estrazione del cambiamento medio del segnale percentuale (facce > case) per ciascuno dei quattro gruppi ha indicato l’assenza di differenze di gruppo nella risposta ai volti rispetto alle case in queste regioni di interesse definite in modo indipendente quando si confrontano i gruppi TD: convalida e HFASD e quando si confrontano i gruppi LFASD e CDD. Le facce > risposta case all’interno del gruppo CDD non era significativamente maggiore di zero, suggerendo una generale mancanza di sensibilità ai volti nella rete occipitotemporale faccia sensibile nel suo complesso. C’è una constatazione consolidata di ipoattivazione ai volti (rispetto alle case) nel destro, giro fusiforme medio in HFASD rispetto a TD. Siamo stati in grado di replicare questo risultato nelle nostre coorti. Tuttavia, il confronto di volti > attività case in CDD rispetto a TD non ha rivelato alcuna differenza significativa, come ha fatto il confronto dei gruppi LFASD e TD (Additional file 1: Figura S2 e Additional file 2: Tabella S12).

Data la possibile mancanza di sensibilità ai volti nella corteccia occipitotemporale ventrolaterale in CDD, abbiamo poi condotto una valutazione whole-brain dei soggetti CDD per localizzare i substrati neuroanatomici della percezione del volto in questi individui. Come illustrato in Fig. 5a, i soggetti CDD esposti volti > case attività nel giro frontale medio, giro precentrale, caudato (striato), talamo, ippocampo, e cervelletto (file aggiuntivo 2: Tabella S13). Questi si sovrappongono con le regioni del cervello determinato ad avere i più alti livelli di espressione del gene candidato CDD (Fig. 1). Come mostrato in Fig. 5b e Additional file 2: Tabella S14, il confronto del cambiamento medio del segnale percentuale (facce > case) da queste regioni di interesse ha rivelato una differenza significativa tra CDD e HFASD , ma nessuna differenza significativa tra CDD e LFASD . Il gruppo LFASD ha mostrato un fenotipo intermedio a quello dei gruppi HFASD e CDD (Fig. 5b).

Comportamento dello sguardo

Abbiamo raccolto dati di eye-tracking per quantificare il fenotipo sociale delle nostre quattro coorti come hanno visto volti emotivi. Come mostrato nel file aggiuntivo 2: Tabelle S15 e S16, i gruppi non erano significativamente diversi per sesso, età e durata totale di fissazione sull’immagine. I gruppi CDD e LFASD non erano anche significativamente diversi per QI e gravità dell’autismo, e i gruppi HFASD e TD non erano significativamente diversi per QI. Come mostrato in Fig. 6, replichiamo i risultati precedenti di una diminuzione della fissazione degli occhi e di un aumento della fissazione della bocca nel HFASD rispetto al TD. Tuttavia, mentre la percentuale di tempo che i soggetti con LFASD trascorrevano guardando gli occhi non differiva significativamente dal gruppo HFASD, i soggetti CDD fissavano gli occhi significativamente di più rispetto al gruppo HFASD. Rispetto agli altri, i soggetti CDD e LFASD non differivano significativamente nel tempo trascorso a guardare gli occhi. Come per i risultati fMRI (Fig. 5b), il gruppo LFASD ha mostrato un fenotipo intermedio a quello dei gruppi HFASD e CDD (rapporto occhi-bocca, Additional file 2: Table S16).