Para estudiar el efecto del aumento de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción, el sustrato debe estar presente en una cantidad excesiva; es decir, la reacción debe ser independiente de la concentración de sustrato. Cualquier cambio en la cantidad de producto formado durante un periodo de tiempo determinado dependerá del nivel de enzima presente. Gráficamente, esto puede representarse como:
Se dice que estas reacciones son de «orden cero» porque las tasas son independientes de la concentración de sustrato y son iguales a alguna constante k. La formación de producto procede a una tasa que es lineal con el tiempo. La adición de más sustrato no sirve para aumentar la velocidad. En la cinética de orden cero, al permitir que el ensayo se ejecute durante el doble de tiempo se obtiene el doble de cantidad de producto.
| Orden | Ecuación de velocidad | |
|---|---|---|
| Tasa cero | = k | tasa es independiente de la concentración de sustrato |
| primera | tasa = k | tasa es proporcional a la primera potencia de la concentración de sustrato |
| segunda | velocidad = k=k2 | velocidad es proporcional al cuadrado de la concentración de sustrato |
| segunda | velocidad = k | la velocidad es proporcional a la primera potencia de cada uno de los dos reactivos |
La cantidad de enzima presente en una reacción se mide por la actividad que cataliza. La relación entre la actividad y la concentración se ve afectada por muchos factores como la temperatura, el pH, etc. Un ensayo enzimático debe diseñarse de forma que la actividad observada sea proporcional a la cantidad de enzima presente para que la concentración de enzima sea el único factor limitante. Sólo se satisface cuando la reacción es de orden cero.
En la figura 5, la actividad es directamente proporcional a la concentración en la zona AB, pero no en la BC. La actividad enzimática suele ser mayor cuando la concentración de sustrato es ilimitada.
Cuando se representa la concentración del producto de una reacción enzimática en función del tiempo, resulta una curva similar, Figura 6.
Entre A y B, la curva representa una reacción de orden cero; es decir, una en la que la velocidad es constante con el tiempo. A medida que se agota el sustrato, los sitios activos de la enzima dejan de estar saturados, la concentración de sustrato se convierte en limitante de la velocidad y la reacción pasa a ser de primer orden entre B y C.
Para medir la actividad enzimática de forma ideal, las mediciones deben realizarse en la parte de la curva en la que la reacción es de orden cero. Lo más probable es que una reacción sea de orden cero inicialmente, ya que la concentración de sustrato es entonces la más alta. Para estar seguro de que una reacción es de orden cero, deben realizarse múltiples mediciones de la concentración de producto (o sustrato).
La figura 7 ilustra tres tipos de reacciones que pueden encontrarse en los ensayos enzimáticos y muestra los problemas que pueden encontrarse si sólo se realizan mediciones individuales.
B es una línea recta que representa una reacción de orden cero que permite determinar con precisión la actividad enzimática durante parte o todo el tiempo de reacción. A representa el tipo de reacción que se mostró en la Figura 6. Esta reacción es de orden cero inicialmente y luego se ralentiza, presumiblemente debido al agotamiento del sustrato o a la inhibición del producto. Este tipo de reacción se denomina a veces reacción «líder». La verdadera actividad «potencial» está representada por la línea de puntos. La curva C representa una reacción con una fase inicial de «retardo». De nuevo, la línea de puntos representa la actividad potencialmente medible. Las múltiples determinaciones de la concentración de producto permiten trazar cada curva y determinar la verdadera actividad. Una única determinación del punto final en E llevaría a la falsa conclusión de que las tres muestras tenían una concentración de enzima idéntica.