PMC

A Dayan és Wraith által nemrégiben ebben a folyóiratban megjelentetett szerkesztőségi cikk rávilágított az új immunterápiák fejlesztésének kihívásaira a TGN1412 katasztrofális kísérlete után. Ez az áttekintés az anti-D számos klinikai vizsgálatából származó néhány olyan ismeretet mutat be, amelyek relevánsak lehetnek a transzlációs immunológia számára.

A hydrops fetalis vagy a magzat és újszülöttek Rhesus hemolitikus betegségének (HDFN) megelőzése profilaktikus anti-D-vel az antitest-közvetített immunszuppresszió legsikeresebb klinikai alkalmazása. A HDFN azután következik be, hogy egy D-negatív nő immunizálódik a magzati D-pozitív vörösvértestekkel a fetomaternális vérzést (FMH) követően; a termelt IgG anti-D átkerül a placentán, ami a lép makrofágjai által a magzati vörösvértestek pusztulását okozza. Az 1940-es években, amikor először ismerték fel a betegség okát, a csecsemők 1%-a született HDFN-vel, és 40%-uk meghalt. Az anti-D a leggyakoribb antitest. A vörösvértesteken lévő RhD polipeptid a vércsoport antigének közül a legimmunogénebb, mivel hiányzik a D-negatív egyének sejtjeiből, akiknél hiányzik az RHD gén .

A HDFN ma már ritka, részben a magzati és újszülöttkori ellátás javulásának köszönhetően, de főként azért, mert a fogékony D-negatív nők elsődleges immunizálását megelőzte a profilaktikus IgG anti-D . 1968 óta, az Egyesült Királyságban és az USA-ban végzett sikeres klinikai kísérleteket követően, az anti-D-t az összes nő 10%-ának adják szülés után, ami a betegség előfordulásának mintegy 95%-os csökkenését eredményezte. Ma már évente kevesebb mint 30 perinatális halálesetet okoz a HDFN. 2002-ben a National Institute of Health and Clinical Excellence (NICE) azt javasolta, hogy a szülés utáni profilaxis mellett minden D-negatív nőnek rutinszerűen szülés előtti D-ellenes profilaxist is adjanak, hogy tovább csökkenjen az immunizációs arány. Az intravénás (IV) anti-D-t ma már terápiásan is alkalmazzák néhány D-pozitív, immuntrombocitopéniás purpurában (ITP) szenvedő beteg kezelésére. Így az anti-D iránti kereslet növekszik.

Az anti-D immunglobulint összevont hiperimmun humán plazmából állítják elő. A virológiai biztonságossággal kapcsolatos kérdések és újabban a Creutzfeld-Jacob-kór variáns (vCJD) évek óta serkentik az alternatív készletek keresését. Az Egyesült Királyságban a frakcionálásra szánt plazmát ma már észak-amerikai donoroktól szerzik be, mivel aggályok merültek fel azzal kapcsolatban, hogy a brit donorok a vCJD látens hordozói lehetnek. Azzal a céllal, hogy a humán plazmából előállított poliklonális anti-D-t a diagnosztikai és klinikai felhasználásra szánt biotechnológiai változatokkal helyettesítsék, több száz monoklonális (mAb) vagy rekombináns (rAb) anti-D antitestet állítottak elő. Ezek mind emberi immunglobulin-génekből vagy B-sejtekből származnak, mivel az egerek nem ismerik fel az RhD antigént. Különböző expressziós rendszereket használtak, beleértve humán B-sejtvonalakat, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket, egér-humán heterohibridómákat és patkány myelómákat.

Bár a D immunizáció passzív IgG anti-D adásával történő szuppressziójának pontos mechanizmusa még tisztázásra vár, ismert, hogy a D-pozitív vörösvértesteket a makrofágok az IgG Fc receptor (FcγR) kölcsönhatásán keresztül gyorsan kiürítik a lépbe és nem immunogénné teszik. Valóban, annak biztosítása érdekében, hogy a profilaktikus anti-D valószínűleg hatékony legyen a D immunizáció megelőzésében egy nagy FMH-hoz, a nőket 2-3 nappal később tesztelik, hogy ellenőrizzék, hogy a magzati sejtek kiürültek-e a keringésből . Egyébként az allogén vörösvérsejtek hosszú túlélési idővel rendelkeznek az FMH vagy a transzfúzió után. Az alloimmun válaszok lassan alakulnak ki, az anti-D esetében jellemzően 5-15 hétig . Ez valószínűleg annak köszönhető, hogy nem rendelkeznek veszélyjelzésekkel (idegen molekulákból), így az immunrendszer nem ismeri fel őket, amíg el nem öregednek, ami aztán a foszfatidil szerin receptorokon keresztül serkenti a fagocitózist . RhD-profilaxis nélkül a D-negatív nők körülbelül 17%-a immunizálódik a D-pozitív magzattal való terhesség után . Ez az előfordulási gyakoriság alacsonyabb, mint a szándékosan immunizált normál alanyok esetében (akár körülbelül 85% is reagálhat ), mivel a legtöbb nő esetében az FMH mennyisége túl kicsi ahhoz, hogy a vörösvértestek immunogénnek bizonyuljanak . A terhes nők robusztus alloimmun válaszokat adhatnak, miközben tolerálják a félig allogén magzatot.

Az elmúlt 20 év során 19 anti-D mAb-t és rAb-t teszteltek 15 first-in-man vizsgálatban. Ezeket a közelmúltban áttekintettük, és itt foglaljuk össze. Súlyos mellékhatások nem fordultak elő. Az FcγR által közvetített fagocitózis és hemolízis in vitro biológiai vizsgálatai humán effektorsejtek felhasználásával jól megalapozottak, és ezeket használták a szűréshez. A klinikai vizsgálatokban azt vizsgálták, hogy az antitestek képesek-e kis mennyiségű (kevesebb mint 1%) D-pozitív vörösvérsejtet eltávolítani a keringésből, majd néhány vizsgálatban azt is meghatározták, hogy az antitestek képesek-e megakadályozni a D-immunizációt. Számos mAb-t és rAb-t közvetlenül összehasonlítottak poliklonális anti-D-vel.

Az antitestek hatékonyságában nagyfokú heterogenitást figyeltek meg (1. táblázat). Két humán B-limfoblasztoid sejtvonalból származó mAb, a BRAD-3 és BRAD-5, gyors vörösvérsejt-tisztulást közvetített, és majdnem olyan hatékonyan akadályozta meg a D immunizációt, mint a poliklonális anti-D, bár háromszor-négyszer nagyobb dózist használtak . A BRAD-3 és BRAD-5 plazma felezési ideje normális volt, de a biológiai hasznosulás fele volt a poliklonális anti-D-nek . Amikor ezeket az antitesteket rAbs-ként CHO-sejtekben fejezték ki, az autológ D-pozitív vörösvértestek kiürülése lassabb volt, mint az eredeti mAbs-eké . Egy másik CHO-eredetű anti-D rAb, a MonoRho felhasználásával végzett nagy vizsgálat kiábrándító eredményeket hozott, a vörösvérsejtek kiürülése rendkívül változó volt, általában nagyon lassú, és nem korrelált az anti-D dózisával. A MonoRho nagyon alacsony biológiai hozzáférhetősége részben magyarázhatja ezt. Az alanyok azonban nem termeltek anti-D-t, bár nem kaptak D-pozitív vörösvérsejtek kihívó injekcióját a D-immunizációs státuszuk meghatározásához . Az egér-mielóma sejtvonalak (egér-ember heterohibridómaként) által termelt MAbs-ok szintén nagy variabilitást mutattak a vörösvérsejtek kiürülésében, de váratlanul a recipiensek több mint fele gyorsan D-immunizált lett , kétszer annyian, mint ahányan csak vörösvérsejtekkel . Így ezek a D-ellenes szerek adjuváns hatásúak voltak, fokozták a D-pozitív vörösvértestekre adott immunválaszt, ahelyett, hogy a szándékolt módon megakadályozták volna azt. Későbbi vizsgálatok patkány myelóma sejtek által termelt anti-D rAbs-okkal azt mutatták, hogy ezek elősegítették az autológ vörösvértestek rendkívül gyors kiürülését, gyorsabban, mint a poliklonális anti-D . A FOG-1-et expresszáló sejtvonal egérről patkányra történő megváltoztatásának hatása szembetűnő volt, a kiürülést nagyon lassúról és hiányosról nagyon gyorsra változtatta. Ez utóbbi vizsgálatban ez hemolízissel, némi májba történő kiürüléssel és lázas reakciókkal járt . Ezek a reakciók nem jelentkeztek poliklonális anti-D-vel végzett profilaxis után. Váratlanul a FOG-1 rAb mutánsai, amelyeknek in vitro hiányzott az FcγR kölcsönhatása, szintén gyors vörösvérsejt-tisztulást közvetítettek, bár normális túlélést vártak. Ezeknek az IgG anti-D-knek az IgG FcγR-től eltérő receptorokhoz kellett kötődniük.

A sok D-ellenes mAb és rAb nem úgy viselkedett, mint a poliklonális anti-D. Egyik sem volt egészen olyan hatékony, és néhány rágcsálósejtvonalból származó még nemkívánatos immunválaszt is eredményezett. Az in vivo válaszokat elsősorban az antitesteket termelő sejtvonal faja határozta meg, nem pedig a fehérje szekvenciája. E váratlan és esetleg káros reakciók oka az lehet, hogy az állati sejtekből előállított IgG anti-D kölcsönhatásba lépett a veleszületett immunrendszer összetevőivel. A legvalószínűbb magyarázat az oligoszacharid-összetételük eltérése.

Az IgG glikozilációjának típusa attól a sejttől függ, amelyben termelődik, és fajspecifikus. Az olyan struktúrákat, mint az N-glikolil neuraminsav és a magas mannóz tartalmú oligoszacharidok a rágcsálók IgG-jén, a veleszületett immunrendszer mintafelismerő receptorai (PRR) idegenként ismerhetik fel, ami pro-inflammatorikus válaszokat eredményezhet. A PRR-ek közé tartoznak a sejtes asialoglikoprotein és a mannóz receptorok. A D-pozitív vörösvérsejteken lévő anti-D kötődés után a D-antigénnel szembeni antitestválaszt stimulálhatták. A plazmában a mannánkötő lektin a vörösvérsejt anti-D mannózmaradványaihoz kötődve komplementmediált hemolízist okozhat. Az egér IgG-n található galaktóz-α1,3-galaktózt felismerő endogén IgG antitestek az ezt az oligoszacharidot expresszáló anti-D-t meg tudják kötni. A közelmúltban endogén IgE anti-galaktóz-α1,3-galaktóz túlérzékenységi reakciókat okozott néhány betegnél, akik cetuximabot (rákellenes immunterápiás szer) kaptak, amelyet egér myeloma SP2/0 sejtekben termeltek. A szialinsav hiánya számos anti-D mAb-n és rAb-n az IgG-t az FcγR-hez kötődve gyulladáskeltővé tenné .

A poliklonális anti-D különböző klinikai körülmények között előnyös vagy halálos lehet. A célvörösvérsejtek dózisa fontos tényező. A kis mennyiségű vörösvérsejtek kiürülése, mint az FMH-ban, egy “csendes”, nem gyulladásos, nem hemolitikus folyamat. Ha azonban egy D-pozitív egyén nagy dózisú anti-D-t kap, mint például RhD hemolitikus betegségben szenvedő magzat vagy ritkán IV anti-D-vel kezelt ITP-s betegek esetében, súlyos hemolízis léphet fel. Ezekben az esetenként halálos kimenetelű esetekben a további tünetek általában a HDFN esetében a hydrops (ödéma), ITP-s betegeknél pedig az akut hemoglobinaemia, a hemoglobinuria és a disszeminált intravaszkuláris koaguláció . Az akut hemolízis legtöbb esetét inkább robusztus extravascularis (makrofág közvetítésű) hemolízisnek, mint intravascularis hemolízisnek tekintették . Még ilyen súlyos mellékhatások hiányában is, az ITP-s betegek nem ritkán lázat és hidegrázást tapasztalnak az intravénás anti-D infúzió után, ami gyulladásos reakciókra utal. Így ha az ITP-s betegeket a jelenlegi poliklonális anti-D helyett pro-inflammatorikus anti-D mAb-okkal vagy rAb-okkal kezelnék, nem szándékolt és potenciálisan veszélyes reakciók összetett sorozata következhetne be.

A TGN1412 1. fázisú vizsgálatot követően az anti-D klinikai vizsgálatainak néhány szempontja hasznos lehet más immunterápiás szerek, különösen a vérben lévő sejtek ellen irányuló első emberen végzett vizsgálatok jövőbeli fejlesztése és szabályozása szempontjából (2. táblázat). Különösen fontos a kezdő dózis megválasztása. A vörösvérsejtek és az anti-D alacsony dózisát alkalmazták az összes emberen végzett munka során. Néhány vizsgálatban, például a BRAD-3 esetében, autológ vörösvértesteket (0-5 ml) vontak be ex vivo anti-D-vel, majd megmosták és beadták, így minimalizálva az antitest dózisát és csökkentve a káros hatások lehetőségét. Az ilyen kis mennyiségű vörösvérsejtek kiürülését pontosan nyomon lehetett követni, ha izotópos jelöléssel látták el őket. Amikor ez az antitest biztonságosnak és hatékonynak bizonyult, az anti-D-t és a vörösvértesteket külön injekciózták be, hogy jobban szimulálják a klinikai helyzetet. Az anti-D és a vörösvérsejtek kis dózisával járó gyulladásos reakciók bizonyítékai óvatosságot kell, hogy biztosítsanak a méretnövelő vizsgálatokban.

Következtetés, az anti-D mAbs és rAbs humán vizsgálatokból származó kiterjedt adatok azt sugallják, hogy glikozilációjuk erőteljes hatással lehetett in vivo aktivitásuk modulálására. Néhány rAbs inkább növelte, mint csökkentette a D-immunizáció előfordulását, egy káros hemolitikus reakciókat okozott, egy pedig rendkívül alacsony biohasznosulást mutatott. Ezeket a hatásokat az elvégzett in vitro vizsgálatok nem jelezték előre. A jövőben a humán terápiára szánt rekombináns glikoproteinek kifejlesztésekor figyelembe kell venni annak lehetőségét, hogy a nem humán oligoszacharidok és a tervezett ligandtól eltérő sejtek vagy molekulák között kölcsönhatások léphetnek fel.