Fluoreszcencia

A fluoreszcencia a hideg testekben többnyire optikai jelenségként előforduló lumineszcencia, amelyben egy bizonyos hullámhosszúságú foton molekuláris elnyelése egy másik, hosszabb hullámhosszú foton kibocsátását váltja ki. A fluoreszkáló anyagot fluorofórnak nevezzük. Az elnyelt és a kibocsátott fotonok közötti energiakülönbség molekuláris rezgések vagy hő formájában végződik. Általában az elnyelt foton az ultraibolya tartományban, a kibocsátott fény pedig a látható tartományban van, de ez függ az alkalmazott fluorofortól és más tényezőktől.

A fluoreszcencia nevét a kalcium-fluoridból álló fluorit nevű ásványról kapta, amely gyakran mutatja ezt a jelenséget. Számos más ásvány és szerves anyag is fluoreszkál, és ezeket számos különböző alkalmazásban használják. A fluoreszcencia például hasznos a molekulák megvilágítására és jelölésére az analitikai kémiában és a biokémiában. A fluorofórokat sejtek, antitestek és más biológiai struktúrák jelölésére, valamint szerkezetük és hatásmechanizmusuk meghatározására használják.

Példák fluoreszkáló anyagokra

A drágakövek, ásványok, szálak és sok más anyag, amelyekkel a törvényszéki vizsgálatok során vagy különböző gyűjteményekkel kapcsolatban találkozhatunk, jellegzetes fluoreszcenciával rendelkezhetnek, vagy különbözőképpen fluoreszkálhatnak rövidhullámú ultraibolya, hosszúhullámú ultraibolya vagy röntgensugárzás hatására.

A kalcit és a borostyán sok fajtája fluoreszkál rövidhullámú UV sugárzás hatására. A rubinok, smaragdok és a Hope-gyémánt rövidhullámú UV-fényben vörös fluoreszcenciát mutatnak; a gyémántok röntgensugárzás hatására is fényt bocsátanak ki.

A nyersolaj (kőolaj) többféle színben fluoreszkál, a nehézolajok és kátrányok tompa barnájától a nagyon könnyű olajok és kondenzátumok élénksárgás és kékesfehér színéig. Ezt a jelenséget a kőolajkutató fúrásoknál használják a fúrási maradékban és a magmintában lévő nagyon kis mennyiségű olaj azonosítására.

A szerves folyadékok, például az antracén keverékei benzolban vagy toluolban, vagy a sztilbén ugyanezekben az oldószerekben, ultraibolya vagy gammasugárzás hatására fluoreszkálnak. Ennek a fluoreszcenciának a bomlási ideje nanoszekundumos nagyságrendű, mivel a fény időtartama a fluoreszcens anyag, ebben az esetben az antracén vagy a sztilbén gerjesztett állapotainak élettartamától függ.

Alkalmazások

Sok természetes és szintetikus vegyület mutat fluoreszcenciát, és számos alkalmazásuk van. Néhány mélytengeri állat, például a zöldszemű, használja a fluoreszcenciát.

Világítás

A közönséges fluoreszkáló cső a fluoreszcenciára támaszkodik. Az üvegcső belsejében részleges vákuum és kis mennyiségű higany van. A csőben lévő elektromos kisülés hatására a higanyatomok fényt bocsátanak ki. A kibocsátott fény az ultraibolya (UV) tartományban van, láthatatlan, és a legtöbb élő szervezet számára káros. A csövet egy foszfornak nevezett fluoreszkáló anyagból készült bevonattal bélelik, amely elnyeli az ultraibolyát, és újra látható fényt bocsát ki. A fluoreszcens világítás az izzó technológiához képest nagyon energiatakarékos, de a keletkező spektrum miatt bizonyos színek természetellenesnek tűnhetnek.

A 90-es évek közepén megjelentek a fehér fényt kibocsátó diódák (LED-ek), amelyek hasonló eljárással működnek. Jellemzően a tényleges fénykibocsátó félvezető a spektrum kék részében termel fényt, amely a chipen lerakott foszforvegyületre esik; a foszfor a spektrum zöldtől vörösig fluoreszkál. A foszforon áthaladó kék fény és a foszfor által kibocsátott fény kombinációja fehér fény nettó kibocsátását eredményezi.

A modern higanygőz utcai lámpa állítólag a fénycsőből fejlődött ki.

A fénycsövek fenil-oxalát-észtert oxidálva fényt termelnek.

A kompakt fénycső (CFL) ugyanaz, mint bármelyik tipikus fénycső, előnyökkel. Öntöltős, és a legtöbb alkalmazásban az izzók kiváltására használják. Lumenenként negyedannyi hőt termelnek, mint az izzólámpák, és körülbelül ötször annyi ideig tartanak. Ezek az izzók higanyt tartalmaznak, ezért óvatosan kell kezelni és ártalmatlanítani őket.

Analitikai kémia

A fluoreszcencia több hullámhosszon is detektálható tömbös detektorral, a HPLC áramlásból származó vegyületek kimutatására. A vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) lemezek is láthatóvá tehetők, ha a vegyületek vagy egy színező reagens fluoreszcens.

Az ujjlenyomatok láthatóvá tehetők fluoreszcens vegyületekkel, például ninhidrinnel.

Biokémia és orvostudomány

A biológiai molekulákat egyszerű kémiai reakcióval fluoreszcens kémiai csoporttal (fluorofórral) lehet jelölni, és a jelölés fluoreszcenciája lehetővé teszi a molekula érzékeny és mennyiségi kimutatását. Példák:

• A szövetek, sejtek vagy szubcelluláris struktúrák fluoreszcens mikroszkópiája úgy valósul meg, hogy egy antitestet fluorofórral jelölnek, és lehetővé teszik az antitest számára, hogy megtalálja a célantigént a mintában. Több antitest különböző fluorofórral történő jelölése lehetővé teszi több célpont láthatóvá tételét egyetlen képen belül.
• A DNS automatizált szekvenálása a láncvégződési módszerrel; a négy különböző láncvégződési bázis mindegyikéhez saját specifikus fluoreszcens címke tartozik. A jelölt DNS-molekulák szétválasztásakor a fluoreszcens jelölést UV-forrás gerjeszti, és a kibocsátott fény hullámhossza alapján azonosítható a molekulát végző bázis azonossága.
• DNS-detektálás: az etídium-bromid vegyület, ha oldatban szabadon változtatja konformációját, nagyon kis fluoreszcenciával rendelkezik. Az etídium-bromid fluoreszcenciája nagymértékben felerősödik, amikor DNS-hez kötődik, ezért ez a vegyület nagyon hasznos a DNS-darabkák helyének láthatóvá tételére agaróz gélelektroforézisben. Az etídium-bromid mérgező lehet; biztonságosabb alternatíva a SYBR Green nevű festék.
• A DNS-mikroarray
• Immunológia: Egy antitesthez fluoreszcens kémiai csoport kapcsolódik, és a fluoreszcencia alapján láthatóak, sőt számszerűsíthetőek azok a helyek (pl. egy mikroszkópos mintán), ahol az antitest kötődött.
• FACS (fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás)
• A fluoreszcenciát a DNS és a fehérjék szerkezetének és konformációjának vizsgálatára használják olyan technikákkal, mint a fluoreszcencia-rezonancia energiaátvitel, amely a távolságot angström szinten méri. Ez különösen fontos több biomolekulából álló komplexek esetében.
• Aequorin, amely az Aequorea victoria medúzából származik, Ca2+ ionok jelenlétében (kémiai reakció révén) kéken világít. A sejtekben történő kalciumáramlás valós idejű leképezésére használták. Az aequorinnal elért siker az A. victoria további vizsgálatára ösztönzött, és a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) felfedezéséhez vezetett, amely rendkívül fontos kutatási eszközzé vált. A GFP-t és a rokon fehérjéket riporterként használják számos biológiai eseményre, beleértve például a szubcelluláris lokalizációt is. A génexpresszió szintjét néha úgy mérik, hogy a GFP előállítására szolgáló gént egy másik génhez kapcsolják.

Egyébként sok biológiai molekula rendelkezik saját fluoreszcenciával, amely néha kémiai címkék csatolása nélkül is felhasználható. Néha ez a saját fluoreszcencia megváltozik, amikor a molekula egy adott környezetben van, így a molekula eloszlása vagy kötődése mérhető. A bilirubin például erősen fluoreszkál, amikor a szérumalbumin egy meghatározott helyéhez kötődik. A cink-protoporfirin, amely a fejlődő vörösvértestekben a hemoglobin helyett képződik, amikor a vas nem áll rendelkezésre vagy ólom van jelen, fényes fluoreszcenciával rendelkezik, és felhasználható e problémák kimutatására.

2006 óta a fluoreszcencia alkalmazásainak száma egyre nő az orvosbiológiai biológiai és a kapcsolódó tudományokban. Ezeken a területeken az elemzési módszerek is egyre bővülnek, bár egyre szerencsétlenebb nevezéktannal, olyan rövidítések formájában, mint például: FLIM, FLI, FLIP, CALI, FLIE, FRET, FRAP, FCS, PFRAP, smFRET, FIONA, FRIPS, SHREK, SHRIMP, TIRF. E technikák többsége fluoreszcens mikroszkópokra épül. Ezek a mikroszkópok nagy intenzitású fényforrásokat, általában higany- vagy xenonlámpákat, LED-eket vagy lézereket használnak a megfigyelt minták fluoreszcenciájának gerjesztésére. Ezután optikai szűrők választják el a gerjesztő fényt a kibocsátott fluoreszcenciától, amelyet szemmel, vagy (CCD) kamerával vagy más fénydetektorokkal (fotomultiplier csövek, spektrográfok stb.) lehet detektálni. Számos kutatás folyik az ilyen mikroszkópok, a használt fluoreszcens szondák és az általuk alkalmazott alkalmazások képességeinek javítása érdekében. Külön említést érdemelnek a konfokális mikroszkópok, amelyek egy tűlyukat használnak az optikai metszés eléréséhez – kvantitatív, 3D-s képet nyújtva a mintáról.

Biztonság

A fluoreszcens izzók sokkal kevesebb hulladékhőt termelnek, mint az izzók és a halogén izzók. A halogén izzók számos tűzesetben érintettek, és az izzók is nagyobb tűzveszélyt hordoznak, mint a fénycsövek, a hulladékhő miatt. A lámpák véletlenül, vagy néha olyan események, mint például földrengések következtében is felborulhatnak. A fénycsövek használata tehát a véletlen tűzesetek megelőzésének egyik eszköze lehet. A fénycsövek azonban higanyt tartalmazhatnak, és egy ilyen izzó eltörése költséges higanyszennyezéshez vezethet.

elméleti megfontolások

Fotokémia

Fluoreszcencia akkor keletkezik, amikor egy molekula vagy kvantumpont elektronikus gerjesztés után alapállapotba relaxál.

gerjesztés: S 0 + h ν → S 1 {\displaystyle S_{0}+h\nu \to S_{1}}

Fluoreszcencia (emisszió): S 1 → S 0 + h ν {\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu } , itt h ν {\displaystyle h\nu } a fotonenergia általános kifejezése, ahol: h = Planck-állandó és ν {\displaystyle \nu } = a fény frekvenciája. (A gerjesztett és a kibocsátott fény konkrét frekvenciája az adott rendszertől függ.)

Az S0 állapotot a fluorofór (fluoreszcens molekula) alapállapotának nevezzük, S1 pedig az első (elektronikusan) gerjesztett állapota.

A molekula a gerjesztett állapotában, S1-ben többféle, egymással versengő úton relaxálhat. Átmehet “nem-sugárzó relaxáción”, amely során a gerjesztési energia hő formájában (rezgésként) távozik az oldószerbe. A gerjesztett szerves molekulák relaxálhatnak triplett állapotba való átalakulással is, amely ezt követően foszforeszcenciával vagy egy másodlagos nem-sugárzó relaxációs lépéssel relaxálhat.

Az S1 állapot relaxációja egy második molekulával való kölcsönhatáson keresztül, fluoreszcencia-csillapítással is bekövetkezhet. A molekuláris oxigén (O2) rendkívül hatékony fojtója a fluoreszcenciának, mivel szokatlan triplett alapállapota van.

A fényelnyeléssel vagy más folyamat révén (pl. egy reakció termékeként) gerjesztett molekulák energiát adhatnak át egy második “érzékenyített” molekulának, amely átváltozik a gerjesztett állapotába, és ezután fluoreszkálhat. Ezt az eljárást használják a fénypálcikákban.

Fluoreszcencia kvantumhozam

A fluoreszcencia kvantumhozam a fluoreszcencia folyamat hatékonyságát adja meg. A kibocsátott fotonok számának és az elnyelt fotonok számának hányadosa.

Φ = # p h o t o n s e m i t t e d # p h o t o n s a b s o r b e d {\displaystyle \Phi ={\frac {\rm {\#\\\ fotonok\ kibocsátott}}{\rm {\#\\ fotonok\ elnyelt}}}}

A maximális fluoreszcencia kvantumhozam 1,0 (100 százalék); minden elnyelt foton egy emittált fotont eredményez. A 0,10-es kvantumhozamú vegyületek még mindig eléggé fluoreszkálónak számítanak. A fluoreszcencia kvantumhozamának egy másik módja a gerjesztett állapotok bomlási sebességének meghatározása:

k f ∑ i k i {\displaystyle {\frac {{k}_{f}}}{\sum _{i}{k}_{i}}}}

ahol k f {\displaystyle {k}_{f}}} a sugárzás spontán emissziójának sebessége és

∑ i k i {\displaystyle \sum _{i}{k}_{i}}

a gerjesztett állapotok bomlási rátáinak összege. A gerjesztett állapot bomlásának egyéb sebességeit a fotonemissziótól eltérő mechanizmusok okozzák, ezért gyakran “nem sugárzási sebességeknek” nevezik, amelyek közé tartozhatnak:dinamikus ütközéses kioltás, közeli mező dipólus-dipólus kölcsönhatás (vagy rezonancia energiaátvitel), belső konverzió és rendszerközi kereszteződés. Így ha bármelyik útvonal sebessége megváltozik, az hatással lesz mind a gerjesztett állapot élettartamára, mind a fluoreszcencia kvantumhozamára.

A fluoreszcencia kvantumhozamát ismert kvantológiájú standarddal való összehasonlítással mérik; a kinin só, a kinin-szulfát kénsavas oldatban gyakori fluoreszcencia standard.

Fluoreszcencia élettartam

A fluoreszcencia élettartam arra az átlagos időre utal, amelyet a molekula gerjesztett állapotában tölt, mielőtt fotont bocsát ki. A fluoreszcencia jellemzően elsőrendű kinetikát követ:

= 0 e – Γ t , {\displaystyle \left=\left_{0}e^{-\Gamma t},}

ahol {\displaystyle \left} a gerjesztett állapotú molekulák koncentrációja a t időpontban {\displaystyle t} , 0 {\displaystyle \left_{0}} a kezdeti koncentráció, Γ {\displaystyle \Gamma } pedig a kezdeti koncentráció. a bomlási sebesség vagy a fluoreszcencia élettartam inverze. Ez az exponenciális bomlás egy példája. Különböző sugárzási és nem sugárzási folyamatok leépíthetik a kilépett állapotot. Ilyen esetben a teljes bomlási sebesség az összes sebesség összege:

Γ t o t = Γ r a d + Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{tot}=\Gamma _{rad}+\Gamma _{nrad}}

ahol Γ t o t {\displaystyle \Gamma _{tot}} a teljes bomlási sebesség, Γ r a d {\displaystyle \Gamma _{rad}} a sugárzási bomlási sebesség és Γ n r a d {\displaystyle \Gamma _{nrad}} a nem sugárzási bomlási sebesség. Ez hasonló egy elsőrendű kémiai reakcióhoz, amelyben az elsőrendű sebességi állandó az összes sebesség összege (párhuzamos kinetikai modell). Ha a spontán emisszió sebessége, vagy bármely más sebesség gyors, az élettartam rövid. Az általánosan használt fluoreszcens vegyületek esetében az UV és a közeli infravörös tartományba eső energiájú fotonokat kibocsátó fluoreszcens vegyületek gerjesztett állapotának tipikus bomlási ideje 0,5 és 20 nanoszekundum között van. A fluoreszcencia élettartama fontos paraméter a fluoreszcencia gyakorlati alkalmazásai, például a fluoreszcencia-rezonancia-energiaátvitel szempontjából.

Szabályok

A fluoreszcenciával kapcsolatban számos szabály létezik. A Kása-Vavilov-szabály azt diktálja, hogy a lumineszcencia kvantumhozama független a gerjesztő sugárzás hullámhosszától.

Ez a szabály nem mindig érvényes, és sok egyszerű molekula esetében súlyosan sérül. Valamivel megbízhatóbb állítás, bár még mindig vannak kivételek, hogy a fluoreszcencia spektrum nagyon kevés függést mutat a gerjesztő sugárzás hullámhosszától.

See also

• Fluoreszcein
• Fluoreszcens lámpa
• Light
• Phosphorescence
• X-ray

• Lakowicz, Joseph R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. New York: Springer. ISBN 978-0387312781
• Turro, Nicholas J. 1991. Modern molekuláris fotokémia. Mill Valley, CA: University Science Books. ISBN 0935702717
• Valeur, Bernard. 2002. Molekuláris fluoreszcencia: Principles and Applications. Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 352729919X

All links retrieved April 14, 2017.

• Fluorophores.org A fluoreszcens festékek adatbázisa
• Fluorescence on Scienceworld
• Basic Concepts in Fluorescence